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《南京师范大学》 2007年
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洋桔梗高频再生系统的建立及几丁质酶基因的转化

杨燕燕  
【摘要】: 本研究以洋桔梗(Eustoma grandiflorum)“Double Mariachi Pink”品种为试材,建立了该品种的离体培养高频再生体系;构建了菜豆几丁质酶基因的植物表达载体,并对“Double Mariachi Pink”进行了转化。卡那霉素(Km)抗性筛选和PCR检测结果表明,菜豆几丁质酶基因已转入该品种,为进一步培育抗真菌性病害的洋桔梗新品种奠定了重要基础。 在本研究中,首先以洋桔梗的叶片为外植体,研究了不同的切割方式、培养基中6-BA(0、0.1、0.5和1.0mg/L)与NAA(0、0.01、0.05和0.1mg/L)的不同配比对不定芽分化的影响;并测定了不定芽分化对Km的敏感性。研究结果表明,“五刀切”与“三刀切”对不定芽分化数量的影响无显著性差异,“三刀切,中间不切断”与“三刀切”和“五刀切”相比,不定芽分化数少;MS+6-BA1.0mg/L为叶片不定芽分化的最适培养基;在此培养基上,不定芽分化率达100%,1.0cm×1.0cm大小的叶块上不定芽分化数平均达25.4;将获得的不定芽在MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L培养基中增殖,芽苗在1/2MS+NAA0.1mg/L培养基中生根,从而建立了“Double Mariachi Pink”的高频再生体系。另外,25mg/L的Km为抑制洋桔梗叶片不定芽分化的最低浓度。 然后,根据菜豆Ⅰ类几丁质酶基因序列(M13968——GenBank登录号),设计了一对特异引物(P_1:5’-tac tct aga atg aag aag aat agg atg atg 3’;P_2:5’cgc gaa tcc tca ctg aga ggt gac aag aag-3’),进行PCR扩增;回收扩增产物,进行T-A克隆、测序鉴定表明已分离、克隆了菜豆几丁质酶基因;将该基因与pBI121相连,成功构建了菜豆几丁质酶基因植物表达载体(pBI121-Chi);通过电转化法,将pBI121-Chi导入根癌农杆菌LBA4404中。 最后,将洋桔梗叶片与含pBI121-Chi的LBA4404共培养,经过除菌、Km抗性筛选和再生诱导,获得了20个抗性株系;根据菜豆几丁质酶基因序列和pBI121序列(AF485783)设计PCR引物(P_3:5’-aca gaa ctc gcc gta aag-3’;P_4:5’-atg aag gca tcg tag gtg tag aag c-3’),从11个抗性株系中扩增到了与目的片段长度(832bp)吻合的的特异性条带,表明菜豆几丁质酶基因已整合到洋桔梗基因组中。 此外,本研究还观察到GA_3可促进洋桔梗种苗节间伸长,有效地缩短了育苗期、防止簇生。
【学位授予单位】:南京师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S681.9

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