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《浙江大学》 2009年
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人血小板冷冻干燥保存工艺的优化研究

范菊莉  
【摘要】:冷冻干燥保存法以其保存时间长、稳定性好、储运方便以及复水后迅速恢复活性等优点,为血小板的长期稳定保存提供了一种理想的方法。血小板在冻干保存过程中会面临冷冻损伤,激活损伤,干燥损伤以及复水造成的损伤,目前的血小板冻干保存技术离临床应用还有很大的距离。本文以提高冷冻干燥复水后血小板的形态和功能恢复率为目标,对血小板冻干工艺进行了以下研究工作: 研究了超声波用于辅助海藻糖载入血小板的可行性。在37℃液相内吞作用的基础上,低频超声的加入有利于海藻糖的载入。经频率25 kHz,强度0.4 W/cm2的超声波辐射1h后,海藻糖的平均载入量比传统方法提高了1.46倍。超声处理后的血小板血液学分析、形态观察及流式细胞术分析结果与新鲜血小板不存在显著性差异。 研究了退火环节对血小板冻干效果的影响。通过冻结速率(A)、退火速率(B)、退火温度(C)及退火时间(D)四因素的三水平正交实验及冻干复水后血小板的数值恢复率、细胞形态结构及活化率等指标的检测表明,在其他冻干参数固定的条件下,实验的四个预冻因素对血小板的数值恢复率均有显著作用,影响程度依次为BCDA。预冻的最佳工艺如下:将血小板悬液以20℃/min的速率冻结至-40℃以下,维持2 h,再以1.5℃/min的速率对搁板升温至-30℃后维持0.5 h。经电子显微镜观察,由最佳预冻工艺冻干的血小板超微结构完整。 研究了复水溶液、预复水时间和温度等因素对冻干血小板复水效果的影响。在四种浓度的复水溶液中,浓度为75%的血浆效果最佳,其复水后的血小板恢复率达到(89±3.6)%,PDW增加率最小。对1 mL和2mL冻干样品的预复水研究表明:预复水温度35℃和37℃无显著差别,1 mL样品在37℃的饱和水蒸气中预复水15 min、2 mL样品预复水90 min能使得血小板的恢复率最高,此时,二者含水量基本一致。 在以上冷冻干燥工艺优化研究的基础上,本文进一步检测了冻干血小板的活性指标。采用工艺如下:1mL经海藻糖载入后的血小板悬液以20℃/min的速率冻结至-60℃固化,在-40℃进行一次干燥,20℃进行二次干燥,冻干保存30天后的血小板在37℃下以饱和水蒸气相对分压5.9 kPa的蒸气预复水15 min,再经75%血浆复水。复水后血小板的形态及超微结构保持完整,经1 U/mL凝血酶刺激后,最高聚集率为新鲜血小板对照组的82.8%,在4 min内的聚集速率达到15.75%/min,为新鲜血小板的16.9%。 本文提出的超声波强化海藻糖载入血小板的方法,为哺乳动物细胞冻干保存提供了新的有效的保护剂载入方法。本文优化的血小板冻干工艺对人血小板冷冻干燥保存的大剂量化、临床化具有重要的参考价值。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:TQ464.5

【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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【同被引文献】
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