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人脂联素球状域—胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白的表达及降糖作用测定

吕晶  
【摘要】:前言: 脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞分泌的特异性蛋白,具有增加胰岛素敏感性、降糖、降脂、抗炎、拮抗动脉粥样硬化等作用。C-端球状域(即脂联素球状域,Globular Adiponectin, gAdiponectin, gAd)为其功能域,作用强于全长脂联素。胰升糖素样肽-1(Glucagons-like Peptide-1, GLP-1)是胰岛α细胞和肠粘膜L细胞分泌的一种激素,GLP-1的活性域位于N-端,它可以促进胰岛素的释放,其作用是依赖葡萄糖的。它还具有促进β细胞增生,抑制胰高糖素的分泌,增加肝糖原及肌糖原的合成,降低食欲,抑制胃排空等作用。可GLP-1的体内半衰期很短,在体内GLP-1主要以两种形式进行清除:酶清除与器官清除。 前期研究中应用基因重组技术用一简单的长接头序列基因将gAd的N-端与GLP-1的C-端基因相连,同时,将GLP-1的第8位氨基酸丙氨酸密码子GCT突变为甘氨酸密码子GGT(表达产物为胰升糖素样肽-1类似肽即Glucagons-like Peptide-1-A, GLP-1-A),其N-端引入6个组氨酸标签基因序列(6×His tag基因序列)以及肠激酶识别基因序列,获得了含有脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因的PET28a-脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽重组质粒(PET28a-gAd-GLP-1-A),表达出一种新的融合蛋白即含6个组氨酸标签序列的脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白(6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白)。本研究拟在前期研究的基础上进一步研究gAd-GLP-1-A融合蛋白的获得及其降糖作用测定。6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白被表达,纯化,复性,肠激酶切割。最后用动物实验研究证实了gAd-GLP-1-A融合蛋白具有降糖作用。 材料与方法: 第一:6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的表达 将测序正确的PET28a-gAd-GLP-1-A质粒转化入感受态表达细菌BL21(DE3)。IPTG诱导融合蛋白蛋白的表达,超声破碎分离上清与沉淀(融合蛋白主要存在于包涵体中,包涵体存在于沉淀中),用12%SDS-PAGE和Western Blot鉴定融合蛋白。 第二:gAd-GLP-1-A融合蛋白的获得 将包涵体蛋白洗涤,溶解,而后用Ni-IDA树脂纯化,测定蛋白浓度,于尿素溶液中梯度复性,再进行蛋白浓缩,肠激酶切割,得到gAd-GLP-1-A融合蛋白,用12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western Blot鉴定。 第三:糖尿病鼠模型的建立以及gAd-GLP-1-A融合蛋白的降糖作用测定 腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病小鼠模型。雄性昆明小鼠24只,分为正常对照组,糖尿病对照组和糖尿病治疗组,糖尿病治疗组腹腔注射gAd-GLP-1-A融合蛋白,正常对照组及糖尿病对照组腹腔注射等量的生理盐水,分别在30min,1h,1.5h,2h,2.5h,3h测定血糖,观察血糖变化。 结果: 第一:行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,诱导后菌液与诱导前菌液相比,于25KD左右有较浓的蛋白条带,与预期的6×Histag-gAd-GLP-1-A融合蛋白大小一致,且诱导后菌液沉淀中蛋白条带最粗。用抗His tag单克隆抗体做Western Blot鉴定显示上清及沉淀中均有6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白表达,且该蛋白主要存在于包涵体中 第二:对包涵体蛋白和包涵体纯化蛋白进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot分析,显示6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白得到纯化。 第三:对肠激酶酶切后的蛋白进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot分析,显示肠激酶成功将6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白中的His tag去除,得到了gAd-GLP-1-A融合蛋白。 第四:降糖作用测定中,糖尿病治疗组小鼠腹腔注射gAd-GLP-1-A融合蛋白,正常对照组及糖尿病对照组小鼠腹腔注射等量的生理盐水,结果发现在2h,2.5h,3h时糖尿病治疗组血糖显著低于糖尿病对照组。 结论: 第一:大部分6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白存在于包涵体中。 第二:纯化并复性了包涵体融合蛋白 第三:肠激酶切割6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白,成功将His tag去除,得到gAd-GLP-1-A融合蛋白。 第四:小鼠实验证实了gAd-GLP-1-A融合蛋白具有降糖作用。


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2 唐尚国,邓尚平,周文壁,李双庆,肖邦良,李琼英;糖尿病大鼠肝脏酶组织化学及胰升糖素受体的研究[J];中华内分泌代谢杂志;1993年04期
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11 李长贵,侯善荣,金之欣;食用纤维对肥胖型NIDDM患者的治疗作用[J];中国糖尿病杂志;1997年01期
12 纪立农,韩学尧,毛腾淑;胰升糖素受体Gly40Ser突变与中国北方人群非胰岛素依赖型糖尿病遗传易感性关系的研究[J];中国糖尿病杂志;1999年01期
13 苏本利,李昌臣,郝莉,谷玲,李萍,王希秀,闵长庚;糖尿病患者血浆胰升糖素样肽-1(7-36)测定及其临床意义[J];中国糖尿病杂志;1996年02期
14 何亮家;;高胰升糖素血症——胰腺炎时淀粉酶/肌酐廓清率增加的部分原因[J];国际消化病杂志;1983年04期
15 李利,王海燕;腹膜内比皮下胰岛素治疗能使低血糖时胰升糖素和葡萄糖生成增多[J];国外医学.内分泌学分册;2001年04期
16 劳爱丽;;双重钡剂灌肠检查中使用胰升糖素的效果[J];国际消化病杂志;1984年04期
17 李焱,程桦,钟光恕,刘顺莲,黎锋,傅祖植;优降糖继发失效患者对葡萄糖及胰升糖素的不同反应[J];中华内分泌代谢杂志;1998年05期
18 王野虹,李耀庭;胰岛淀粉蛋白在血糖控制中的作用[J];国外医学.内分泌学分册;1999年02期
19 梁奕铨,余斌杰,姚煜山;胰升糖素-C肽释放试验对指导糖尿病治疗的意义[J];中华内分泌代谢杂志;1993年02期
20 苗述楷;老年糖尿病胰岛功能分析[J];空军总医院学报;1989年04期
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1 马雪;罗晓星;;长效前胰升糖素样肽-1在小鼠体内的降血糖作用[A];中国生理学会、中国神经科学会2005年神经内分泌免疫学术研讨会论文摘要汇编[C];2005年
2 王昱;郭晓蕙;;胰升糖素样多肽-1对胰岛素抵抗大鼠胰腺的保护作用[A];2006年中华医学会糖尿病分会第十次全国糖尿病学术会议论文集[C];2006年
3 马雪;罗晓星;;长效前胰升糖素样肽-1在小鼠体内的降血糖作用[A];中国生理学会、中国神经科学会2005年神经内分泌免疫学术研讨会论文摘要汇编[C];2005年
4 胡昭宇;张彤;张碧霞;叶萍;鲁力;;胰升糖素样肽(GLP-1)测定方法的建立[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
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9 李勇;孙欢娜;;慢性肝病与糖代谢紊乱[A];中国中西医结合学会第十八次全国消化系统疾病学术会议暨2006年全国中西医结合消化系统疾病进展学习班论文汇编[C];2006年
10 武文慧;;中医药治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的研究现状综述[A];第九次全国中医糖尿病学术大会论文汇编[C];2006年
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1 詹宇红;含肠激酶识别序列的人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白的表达与纯化[D];浙江大学;2005年
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3 胡娟;重组exendin-4的克隆、表达与纯化[D];中国协和医科大学;2007年
4 黄崇兵;甲状腺功能亢进症与糖代谢和生长激素的关系[D];安徽医科大学;2009年
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7 刘瑞;Liraglutide对RNAi介导的脂联素基因抑制ApoE~(-/-)小鼠糖脂代谢的影响[D];重庆医科大学;2010年
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1 陆志城;伊森肽注射笔:首种拟肠降血糖素类降糖药[N];医药经济报;2006年
2 陶春祥;胰岛素治疗糖尿病新进展[N];中国医药报;2004年
3 林兰;糖尿病辨证论治规律研究日益深入[N];中国中医药报;2007年
4 李;糖尿病领域新药研发趋势[N];健康报;2006年
5 永生;降糖有药[N];大众卫生报;2000年
6 孙丰雷 杨公涛 高华;大豆的降糖作用[N];中国中医药报;2006年
7 韩峰;治疗2型糖尿病注意事项[N];农村医药报(汉);2009年
8 主任医师 教授 享受国务院政府特殊津贴;中医对糖尿病的认识和治疗特点[N];上海中医药报;2004年
9 文娟;胰岛素与糖尿病的关系[N];中国劳动保障报;2008年
10 罗兴斌;糖尿病人如何应对低血糖[N];大众卫生报;2007年
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