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《浙江大学》 2011年
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青蒿琥酯对人骨肉瘤细胞株HOS增殖抑制作用及其机制研究

蒋晖  
【摘要】:前言: 骨肉瘤是儿童及青少年最常见的原发性骨恶性肿瘤之一,它恶性程度高,预后较差。尽管采用化疗、手术等治疗方式,多数患者仍死于复发和肺转移。近30多年来,随着新辅助化疗的广泛推广,非转移性骨肉瘤患者的五年生存率有很大提高,目前约为55-75%。然而,对于复发或发生肺转移的患者,预后仍然较差,五年生存率不足30%。化疗在骨肉瘤治疗中的地位举足轻重,当前普遍使用的化疗药物有顺铂、阿霉素、异环磷酰胺及大剂量的甲氨蝶呤。但它们往往都具有较大的毒副反应,且骨肉瘤对其容易产生耐药性并最终导致化疗失败。因此,寻找新的有效的化疗药物对骨肉瘤的治疗显得极为重要。 青蒿琥酯(artesunate, ART)是从天然植物青蒿中提取的一种青蒿素衍生物。临床上主要用于恶性疟疾的治疗,且疗效显著。近年来研究发现,它对多种恶性肿瘤如胰腺癌、结肠癌、前列腺癌等具有明显的抗肿瘤活性。甚至,一项临床Ⅱ期试验报道,长期应用青蒿琥酯联合常规化疗药物能明显延长转移性葡萄膜黑色素瘤患者的生存期。然而,迄今为止,关于青蒿琥酯对入骨肉瘤的作用及其相关机制尚未见报道。本研究以人骨肉瘤细胞株HOS为研究对象,探讨青蒿琥酯对骨肉瘤细胞诱导凋亡作用及其具体的作用机制。 目的: 探讨青蒿琥酯对人骨肉瘤细胞株HOS增殖抑制作用,及其相关的分子机制。 方法: 选取生长处在对数期的HOS细胞用于各项实验。采用MTT法于体外检测不同浓度的青蒿琥酯(0、2.5、5、10、20、40、80、160μmol/L)作用于人骨肉瘤HOS细胞和人正常成骨hFOB1.19细胞24、48、72小时后,对细胞的增值抑制作用,并计算其相应的ICso值。于普通光镜下、荧光显微镜下及透射电镜下观察不同浓度的青蒿琥酯对HOS细胞形态的影响;使用Annexin V-FITC/PI标记法流式检测不同浓度的青蒿琥酯处理HOS细胞48小时后相应的凋亡率;并用流式细胞术分析不同浓度的青蒿琥酯处理HOS细胞48小时后细胞周期的分布;利用Western blot法检测不同浓度的青蒿琥酯处理HOS细胞48小时后,其细胞内Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、cytochrone c和Survivin蛋白的表达差异。 统计学处理用SPSS16.0软件完成,计量资料数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示,组间比较采用非独立样本t检验。P0.05表示为差异有统计学意义。 结果: MTT结果显示,青蒿琥酯能明显抑制骨肉瘤HOS细胞增殖,效应呈一定的剂量和时间依赖性。10μmol/L以上的青蒿琥酯作用于HOS细胞48小时以上,与对照组(0μmol/L)相比,差异具有显著统计学意义(P0.01)。青蒿琥酯作用于HOS细胞24、48、72小时的半数有效抑制浓度(IC5o)分别为90.44.52.76.37.38μmol/L.而青蒿琥酯对人正常成骨hFOB1.19细胞生长抑制作用较弱,其24、48、72小时的半数有效抑制浓度(ICso)分别为251.23.206.35.155.18μmol/L.由此可见,青蒿琥酯能选择性抑制骨肉瘤HOS细胞生长。 普通倒置显微镜下,随着青蒿琥酯浓度的增高,HOS细胞的生长密度逐渐降低,漂浮的死亡细胞逐渐增多。Hoechst 33258染色后,在荧光显微镜下观察,与对照组相比,80μmol/L青蒿琥酯药处理过的HOS细胞可见细胞核固缩,大小不一,有的核碎裂成几个浓缩的亮蓝色荧光颗粒等明显的凋亡形态。同样,透射电镜下,青蒿琥酯处理过的HOS细胞仍可看到明显的凋亡特征,表现为细胞表面微绒毛减少,细胞质内聚集大量空泡,细胞核染色质浓缩、核膜不明显等。 Annexin V-FITC/PI标记法流式检测结果表明,随着青蒿琥酯药物浓度的增高,HOS细胞的凋亡率也增高,呈明显的浓度依赖性。0、20、40、80μmol/L的青蒿琥酯作用于HOS细胞48小时后其早期凋亡率分别为4.34%、11.48%、26.99%、44.68%。并且,细胞周期检测结果显示,青蒿琥酯能改变骨肉瘤细胞HOS的细胞周期分布,表现为随药物浓度增高,G1细胞比例依次降低,G2期细胞比例依次增高。 Western Blot证实,随青蒿琥酯浓度的增高,HOS细胞中Bax、cytochrome c的表达依次增高,Bcl-2、survivin的表达依次降低,并且caspase-9、caspase-3蛋白也发生了激活。 结论: 青蒿琥酯能选择性抑制人骨肉瘤细胞株HOS细胞增殖,具体机制可能与其诱导HOS细胞凋亡,阻滞细胞周期G2期有关。青蒿琥酯作为临床上常用的抗疟药物,在骨肉瘤化疗中可能蕴含很好的潜能,值得进一步研究。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285.5;R738

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