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《浙江大学》 2011年
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HIV-1性传播的关键分子DC-SIGN特异性表达机制研究

靳昌忠  
【摘要】:DC-SIGN(全称为树突状细胞特异的胞间黏附分子-3捕获非整合素DC-Specific Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin)是树突状细胞(DC)表面重要的粘附分子受体,它可以诱导DC穿越内皮层,并与ICAM-3结合介导DC与初始T细胞的聚集。此外,作为模式识别受体(PRR), DC-SIGN能够识别和介导多种病原体在人体内的感染并诱导特异性免疫反应,其中研究得最为广泛的是DC-SIGN与HIV-1性传播的关系。生殖道粘膜下DC表面的DC-SIGN可以和HIV-1 gp120蛋白高亲和力结合,将HIV-1吞饮进入胞浆,被保存在胞内小体里,使其感染性维持长达7天之久,并且逃避机体的免疫监视。这些HIV-1保持了很强的感染性,通过DC的迁移到达引流淋巴结,并高效率地感染CD4+T细胞。因此,DC-SIGN在HIV性传播中可能起着决定性的作用。 DC-SIGN之所以在HIV-1性传播中有如此重要的作用,还与它的组织和细胞特异性表达有关。DC-SIGN在体内的表达受到严格的调控,表达范围非常局限,DC-SIGN特异性地高表达于HIV-1性传播密切相关的组织和细胞上。研究发现,DC-SIGN在体内的特异性表达是受IL-4等细胞因子诱导的,但是目前DC-SIGN的这种特异性表达的调控机制仍然不清楚,鉴于DC-SIGN在HIV-1性传播中的重要性,研究DC-SIGN的特异性表达调控机制十分必要。真核细胞基因的特异性表达主要由启动子的活性决定,在本课题中,我们从DC-SIGN启动子入手,研究了其顺式作用元件在DC-SIGN启动子活性中的作用;然后以IL-4诱导THP-1表达DC-SIGN为模型,研究了参与DC-SIGN特异性表达的上游信号通路,初步探索了DC-SIGN特异性表达的调控机制;最后探讨了DC-SIGN启动子与HIV-15'LTR活化的关系。 我们首先以pGL-3荧光素酶报告质粒系统为主要研究工具,用PCR法扩增得到DC-SIGN启动子序列,并通过定点突变的方法得到AP-1和Ets-1转录因子结合位点缺失的DC-SIGN启动子,重组到荧光素酶报告质粒内,转染293T、Hacat和THP-1三种细胞,通过检测荧光素酶活性来反映DC-SIGN启动子的活性。研究结果发现,DC-SIGN的启动子在不同细胞株中活性不同,在THP-1细胞中活性最强,表现出显著的细胞学特异性;AP-1结合位点缺失可以部分降低DC-SIGN启动子的活性(下降达11.85%~75.25%不等),Ets-1结合位点缺失对DC-SIGN启动子活性的影响比AP-1位点显著,使DC-SIGN启动子活性几乎消失(下降达90%以上)。说明Ets-1结合位点在DC-SIGN启动子的活化中起主要作用。 我们进一步研究了激活DC-SIGN启动子的上游信号通路。我们采用IL-4诱导PMA刺激的THP-1细胞这一DC-SIGN的体外表达模型,从nRNA、胞浆和细胞表面蛋白表达三个水平检测了THP-1细胞上DC-SIGN的表达水平,结果发现,IL-4可以大幅提高DC-SIGN在THP-1细胞上的表达,是调节DC-SIGN特异性表达的重要调控因子。我们选取IL-4受体的JAK-STAT和ERK信号通路,以及NF-κB和p38信号通路为目的信号通路,先采用特异的阻断剂阻断信号通路,检测DC-SIGN的表达,再通过检测信号通路相关蛋白的磷酸化水平来反映信号通路的活化。结果显示,在mRNA、胞浆和细胞表面蛋白表达三个水平上,ERK通路阻断剂阻断效果最好,几乎完全阻断了IL-4的诱导效果,JAK-STAT和NF-κB通路阻断剂具有部分阻断效果,而p38通路阻断剂无阻断效果。信号蛋白磷酸化检测结果显示,ERK、JAK-STAT和NF-κB通路均被激活。该部分研究显示,DC-SIGN表达是一个多信号通路参与的过程,其中以ERK通路为主,JAK-STAT和NF-κB通路共同参与,形成一个复杂的调控网络。 最后,我们通过pGL-3荣光素酶报告质粒系统,比较研究了不同信号通路阻断剂对DC-SIGN启动子和HIV-15'LTR的活性的影响。结果发现,IL-4激活的信号通路对HIV-15'LTR也具有活化作用,NF-κB和ERK信号通路参与了HIV-15'LTR的活化。为研究性传播途径中HIV-1感染与DC-SIGN表达的相互促进奠定了基础,也为潜伏感染的HIV-1前病毒的活化提供了新的思路。 综上所述,研究发现: (1)Ets-1结合位点在DC-SIGN启动子的活化中起主要作用; (2)ERK信号通路是IL-4诱导DC-SIGN表达过程中的主要信号通路,并发现NF-κB信号通路也参与了IL-4诱导的DC-SIGN的表达过程; (3)首次对HIV-15'LTR与DC-SIGN启动子活性进行了对比研究,发现IL-4激活的信号通路对HIV-15'LTR也具有活化作用。 本课题首次对DC-SIGN的特异性表达调控机制进行了从启动子到上游信号通路的系统性的专门研究,初步揭示了HIV-1性传播的关键分子DC-SIGN的调控表达机制,为进一步研究和开发阻断HIV-1性传播的药物和手段打下了基础,也为研究HIV-1感染与DC-SIGN表达的相互影响提供了新的思路。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R512.91

【参考文献】
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