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《浙江大学》 2011年
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Th17和Treg细胞在急性肝损伤模型及肠道菌群失调中的作用研究

王华英  
【摘要】:人体肠道是数量众多的细菌群落的自然栖息地,正常肠道菌群在促进免疫系统发育,维持正常免疫功能,协同拮抗病原菌入侵方面发挥着重要作用。在很多疾病如急性肝损伤、肝衰竭发生时肠道菌群明显失衡,造成内毒素血症、细菌移位等,而这些变化主要是由于肠道免疫屏障遭到破坏引起的。肠道免疫系统能区分共栖菌和病原菌,对共栖菌产生免疫耐受,而对病原菌及其他抗原物质产生免疫反应。近来,产生IL-17的CD4+T淋巴细胞被定义为一种新的效应性T细胞亚群,命名为Th17细胞。Th17细胞的产生依赖于肠道共栖菌的存在,并且成为肠道先天免疫屏障的重要组成部分。它的适量存在有助于维持肠道免疫功能,而Th17的过度诱导则会导致肠道免疫功能破坏。在肠道免疫系统对共栖菌的耐受中CD4+CD25+Treg细胞及其产生的抑制性细胞因子IL-10和TGF-β发挥着主要的作用,Th17细胞的分化发育又与Treg细胞分化发育呈相互抑制的关系,因此Th17和Treg细胞是连接肠道菌群和肠道免疫功能的关键细胞亚群。另外,Th17细胞和Treg细胞也在多种肝病如慢性乙型肝炎、急性肝衰竭等的发病中发挥着重要的作用。因此,研究急性肝损伤情况下肠道菌群失调及应用益生菌后机体和肠道Th17/Treg细胞平衡以及相关细胞因子的变化,分析肠道菌群与肠道免疫屏障和机体免疫功能的关系及对急性肝损伤病情转归和预后的影响,对阐明通过改善肠道微生态来提高肠道免疫功能进而改善肝病预后的可能机制具有重要的意义。 我们以沙门氏菌感染导致的肠道菌群紊乱作为对照,采用D-半乳糖胺腹腔注射建立小鼠急性肝损伤模型,运用荧光定量PCR方法和PCR-DGGE方法分析了急性肝损伤模型建立,应用双歧杆菌和乳酸杆菌作为益生菌灌胃后肠道菌群的变化和菌群结构特征,结果发现与正常对照组相比,急性肝损伤后小鼠肠道内潜在致病菌如梭菌属、肠杆菌、粪肠球菌和拟杆菌属的基因拷贝数明显增加,而益生菌双歧杆菌和乳酸杆菌的基因拷贝数则明显降低,肠道菌群发生明显的紊乱,并且发现其菌群结构特征与沙门氏菌感染导致的肠道菌群紊乱有着显著的不同;采用益生菌灌胃后,小鼠肠道内的潜在致病菌数量明显减少,益生菌数量则明显增多,肠道菌群失衡得到明显的纠正,并对肝组织损伤和肝功能具有部分保护的作用。 为了进一步分析急性肝损伤后肠道菌群紊乱情况下机体和肠道免疫功能的变化,我们仍以沙门氏菌感染导致的肠道菌群紊乱作为对照,采用D-半乳糖胺腹腔注射建立小鼠急性肝损伤模型,48小时后分别分离小鼠PBMC和肠道固有层淋巴细胞,采用流式细胞仪技术检测了外周血CD4/CD8比值、外周血和肠道固有层淋巴细胞中Th17细胞和Treg细胞比例,并运用ELISA方法测定了血清中相关细胞因子IL-6、IL-17、IL-23和TGF-β的水平。结果发现,与正常对照组相比,急性肝损伤模型组小鼠外周血CD4/CD8比值明显升高,出现机体免疫紊乱,且外周血Th17细胞比例及Th17细胞分泌的细胞因子IL-17水平均明显增高,与Thl7细胞分化发育和持续存在密切相关的细胞因子IL-6、TGF-β和IL-23水平也明显增高,而Treg细胞的比例却明显下降;肠道固有层淋巴细胞中Th17细胞比例也明显增高,Treg细胞的比例则明显下降。机体和肠道中Thl 7/Treg细胞平衡均遭到破坏。应用益生菌能明显降低外周血和肠道固有层淋巴细胞中Th17细胞的比例,增高Treg细胞比例,一定程度地减轻了Th17/Treg细胞失衡的程度。而且,外周血和肠道固有层淋巴细胞中Th17细胞比例的变化与肝功能的ALT和AST变化呈正相关。 结合上述两部分研究中急性肝损伤以及益生菌应用后肠道菌群的变化特点以及机体和肠道免疫中Th17/Treg细胞平衡变化特点的关系,我们得出以下几点结论: (1)急性肝损伤发生后对肠道菌群产生明显影响,肠道内潜在致病菌数量明显增加,益生菌数量明显减少,肠道菌群紊乱明显,并且其菌群结构特征与沙门氏菌感染导致的肠道菌群紊乱结构特征存在显著不同。 (2)机体和肠道Th17/Treg细胞平衡及相关的细胞因子网络可能参与了急性肝损伤和肠道菌群紊乱的发病过程,Thl7细胞可能可以作为反应急性肝损伤严重程度的间接指标之一,而对该平衡的干预和调节可能是干预急性肝病和肠道菌群紊乱的发生发展及改善预后的新靶点。 (3)益生菌能明显调节肠道菌群紊乱,并可能通过对Th17/Treg细胞平衡的调节改善肠道免疫屏障和机体免疫功能,可在一定程度上保护肝损伤和肝功能。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R575

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【参考文献】
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