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《浙江大学》 2010年
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用于农药残留检测的压电免疫生物传感器的研究

黄君冉  
【摘要】:我国农产品(如蔬菜、茶叶、水果等)中农药残留问题仍相当突出,农药残留超标和农药中毒事件时有报道,农产品中农药残留威胁着人民身体健康。快速测定技术是监控农药残留的有效手段,基于生物传感器的农药残留检测技术具有选择性好、速度快、灵敏度高等优点,是当前国内外农药残留快速检测研究热点,可实现农产品产地或市场快速检测,将农药残留超标农产品挡在市场之外,保障人民健康。 压电免疫传感器因制备简单、灵敏度高、价格低廉、操作方便等优点而被广泛研究并已在生物检测中逐步得到应用。本文以三唑磷农药为检测对象,研究了压电石英晶体金电极表面大分子蛋白质的固定方法,深入探讨了分子自组装技术在蛋白质分子固定中的应用,并将电化学阻抗谱技术和循环伏安法等用于农药残留的检测和分析表征。 本文的主要内容和研究结果如下: (1)研究了基于自组装膜的直接型压电免疫传感器用于三唑磷农药残留的检测。采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对2-巯基苯甲酸(MBA)单分子层修饰的石英晶体电极表面进行活化,将三唑磷单克隆抗体共价结合到电极表面,建立了一种用于快速检测三唑磷农药的压电免疫生物传感器。研究了两种分析过程,分别是浸入-干燥法和流动注射法。免疫传感器可以在40-60分钟内检测5~100μg/mL的目标农药,检出限为4.93μg/mL,三唑磷浓度与晶体频率的变化之间呈良好的线性关系。传感器在检测浓度为5μg/mL标准品稀释液时变异系数为7.1%,检测浓度为50μg/mL农药标准品稀释液时变异系数为9.8%,表明该传感器的可重复性好,能够满足农药残留分析的一般要求。 (2)建立了一种基于自组装技术的固定抗原压电免疫生物传感器,结合流动注射法用于农药残留检测,实验研究了三种自组装材料对人工抗原的固定效果,结果表明三巯基丙酸(MPA)固定人工抗原效果最好。应用该方法检测三唑磷农药标准品稀释液,得出该传感器在5 ng/mL~5 gg/mL范围内,三唑磷浓度与晶体频率的变化之间呈良好的线性关系,得到回归方程y=17.178Ln(x)-147.32,确定系数R2=0.9749,最低检出限为1.85ng/mL。与直接固定抗体从而检测目标抗原模式相比,竞争检测抗原模式下的压电免疫传感器具有更高的灵敏度,更低的检测限。 (3)影响QCM金电极表面蛋白质分子固定的因素有很多,通过对自组装膜的类型,包被缓冲液种类、包被时间、包被温度以及离子强度等因素的筛选比较,优化了三唑磷人工抗原在金电极表面的固定条件。优化后结果显示,采用由两种不同的巯基化合物(硫辛酸和硫辛酰胺)按照3:2体积比形成的混合自组装膜进行人工抗原固定,能够使反应界面羧基密度降低,空间位阻减小,与采用了单一自组装成分固定的方法相比,混合自组装法增大了抗原固定量,同时也降低了非特异吸附。其他因素优化后的结果显示:人工抗原固定以PBS(pH 7.4,0.01 mol/L)作为包被介质较为理想;包被条件以在37℃下包被2h为宜。 (4)使用循环伏安法及电化学阻抗谱法对电极修饰、抗原固定及免疫过程进行了表征,并应用循环伏安法实现了对农药残留的定量检测。在优化了人工抗原固定条件的实验条件下,待测溶液中三唑磷浓度在5 ng/mL~5μg/mL范围时,三唑磷浓度的对数值和THBu-OVA/Au电极与Anti-triazophos/Au电极峰电流差值的绝对值成线性相关关系,相关系数为0.9731,检出限为1.81 ng/mL。
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