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《浙江大学》 2010年
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甘蓝型油菜抗病虫基因遗传转化及转基因植株抗性鉴定的研究

刘宏波  
【摘要】:油菜是世界上最重要的油料作物之一,病虫害的严重影响对油菜产量的提高是一个较大的制约因素,因此油菜抗病虫研究一直是广大研究者的育种目标之一,然而油菜抗性种质资源的匮乏是制约育种进程的重要因素。随着植物基因工程技术的发展和成熟,通过遗传转化将外源抗病虫基因导入到栽培种中,然后对转化后代进行农艺性状和品质性状的定向选择,能够获得高产、优质的抗病虫转基因育种材料,从而扩大油菜抗病虫育种的种质资源。农杆菌介导遗传转化技术在油菜转基因研究中已被广泛应用,然而油菜的遗传转化效率受多种因素的影响,因此建立一套高效的遗传转化再生体系是油菜转基因技术成功的关键。本研究以甘蓝型油菜品种子叶柄为实验材料,对油菜遗传转化再生体系的影响因素进行了分析,并且通过分子生物学实验技术和抗病虫效果评价对外源目的基因的遗传分离规律和表达情况进行了分析,取得的主要研究结果如下: 1.甘蓝型油菜浙双758子叶柄再生体系的建立。研究外源激素的浓度及配比组合、硝酸银和蔗糖浓度等因素对子叶柄外植体再生频率的影响。结果表明,不同浓度2,4-D对子叶柄外植体的愈伤组织诱导率及产生愈伤组织的质量有影响,最适浓度为2.0 mg/L,愈伤诱导率达到89.6%,2,4-D浓度过高会导致产生的愈伤组织畸形,影响再生芽分化率。愈伤组织分化阶段,同时添加3.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA的分化培养基,愈伤组织芽再生频率最高(为53.4%),优于其它配比组合。添加2.5 mg/L AgN03不仅能降低愈伤组织褐化现象,同时能提高愈伤组织芽分化频率,以3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.5 mg/L AgN03的分化培养基芽再生频率最高(达到86.7%)。子叶柄外植体愈伤组织分化出的再生苗存在一定程度玻璃化现象,10 mg/L的蔗糖浓度能维持再生苗的生长,同时能显著改善玻璃化的现象。激素的使用对于再生植株的生根有明显的促进作用,在生根培养基中添加4.0 mg/L IAA,生根率达到91.1%。 2.甘蓝型油菜浙双758子叶柄外植体农杆菌介导遗传转化体系的建立。研究农杆菌侵染浓度、乙酰丁香酮、抑菌素浓度和抗生素筛选浓度等对根癌农杆菌遗传转化效率和转化植株再生的影响。结果发现,添加乙酰丁香酮对子叶柄外植体膨大率并无影响,农杆菌侵染浓度过高则容易导致子叶柄外植体受农杆菌的影响而出现腐烂坏死现象,方差分析表明两者对子叶柄外植体膨大的影响不存在互作效应。羧苄青霉素对农杆菌的抑制效果以500 mg/L的浓度最好,且对子叶柄外植体愈伤组织诱导和分化的影响最小,愈伤组织诱导率和芽再生率分别为75.2%和65.1%。在生根培养阶段以添加100 mg/L头孢霉素能有效抑制农杆菌对再生苗的影响,且不会对再生植株的生根产生影响。5.0 mg/L的潮霉素能完全抑制未转化再生植株的生长,使其最终褐化死亡,在此潮霉素筛选浓度下,我们获得了32株转化再生植株。共培养时培养基中添加100μmol/L AS的芽再生频率为3.9%,显著高于未添加AS的芽再生频率(2.0%),说明在子叶柄外植体转化体系中,共培养阶段添加酚类物质乙酰丁香酮有利于转化载体T-DNA的转化。 3.转化再生植株的分子生物学检测及抗病虫效果的鉴定。经PCR检测,发现其中27株T0代转化再生植株能扩增得到两个外源目的基因,遗传转化率为4.5%。随机选取8株材料进行Southern杂交鉴定,其中4株为单拷贝(T0-11、To-14、To-16、To-26),其余为多拷贝,Northern杂交检测表明蛋白质酶抑制基因在转化植株中经受伤诱导能高效稳定表达。对上述8株转基因材料进行生物学离体抗病虫接种试验,转化植株叶片上接种的小菜蛾4天后平均重量为11.1-19.2mg,存活率仅为5-25%,显著低于对照材料的平均重量(40.3 mg)和存活率(100%)。菌核病菌接种2天后,转化植株能显著抑制病菌的生长,病斑直径平均值为0.73-2.17 cm,显著小于对照材料(2.87 cm)。以上结果说明通过农杆菌转化蛋白质酶抑制基因和几丁质酶基因的再生植株对油菜病虫害有一定的抗性。 4.T1代植株外源目的基因的遗传分离规律和抗病虫效果鉴定。对4株T0代单拷贝转化再生植株(T0-11、T0-14、T0-16、T0-26)的子代进行PCR检测,阳性植株与阴性植株的比例为3:1,经卡平方测验表明外源目的基因分离比符合孟德尔遗传规律,同时也证明4株T0代转化植株外源目的基因的整合方式为单拷贝。RT-PCR和Northern杂交检测表明外源目的基因在T1-11阳性植株中经受伤诱导均能高效稳定表达,且植株之间表达量无明显差异。对T1-11的10株阳性植株进行生物学离体抗病虫接种试验,阳性植株对病虫害的抗性效果与其亲本相当,小菜蛾接种4天后的平均重量为19.6-25.3 mg,存活率为20-40%,显著低于对照材料的平均重量(47.3 mg)和存活率(100%)。菌核菌接种2天后,T1-11的10株阳性植株叶片病斑直径平均值为1.03-1.93 cm,显著小于对照材料(3.17cm),病斑直径平均值平均值为1.57 cm,与亲本材料T0-11的抗性相当(1.17 cm)。以上结果表明外源目的基因在子代中能稳定遗传和高效诱导表达,且子代之间表达量变异较小,同时对油菜病虫害保持着较强的抗性。 综上所述,本试验建立的农杆菌介导高效遗传转化再生体系对油菜组织培养和转基因抗病虫研究有一定的参考价值,所获得的转化再生植株具有较好的抗病虫效果,为油菜抗病虫育种提供了新的抗性种质资源,同时也为油菜抗性育种及生产应用提供理论基础。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S565.4

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