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《浙江大学》 2009年
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姜荆提取物抑菌活性的热动力学研究

屈啸声  
【摘要】:细菌是广泛存在的病原体,它导致的各种疾病给人类的健康和生命带来危害。在疾病的预防和治疗中,除了完全人工合成的抗菌药物之外,植物中含有的某些天然化合物也是抗菌药物的重要来源。采用合适的方法来检测植物的抗菌活性,并分离出相关活性成分是重要的基础性工作。 目前,有多种生物学手段可以用来检测药物的抗菌活性。微量热法能够原位、在线,连续地检测抗菌药物的活性,灵敏度高,操作方便,结果定量程度高,重复性好,已成为抗菌药物研究的重要工具。 在微量热法中,研究者多采用停流法,本文则采用安瓿法进行研究。安瓿法安全性强,其内容物不易泄漏,便于处理,适合用于研究包括病毒等在内的高度危险的对象;安瓿法是一个静态体系,其直接测定结果不会像流动法一样受到流速等因素的影响,真实反映了体系本身的特点,有利于不同实验室工作间的比较。将微量热安瓿法运用于抗菌药物的活性研究具有一定潜力。 本论文主要包括了两个方面的内容一一生物量热和提取物成分分离:着重研究了一种芳香灌木姜荆对两种肠道细菌的抑制活性。探讨了微量热安瓿法测定细菌产热时气氛和溶剂等对细菌代谢热谱的影响,确定了比较合适的实验条件。在此基础上,采用微量热安瓿法研究了用四种不同极性的溶剂(正己烷,氯仿,乙酸乙酯,甲醇)提取姜荆得到的提取物对大肠杆菌和痢疾杆菌的抑制活性。根据微量热实验的结果,进一步对具有抑菌作用的提取物进行了成分分离。详细工作内容和取得的成果有: 1.细菌生长代谢影响因素的考察 以大肠杆菌为例,采用安瓿法测定的细菌生长代谢热谱在指数生长期内和停流法测得的代谢产热之间存在较大的差异,表现为热谱、生长速率常数在第一指数生长期内显现多阶段差异化。这一现象给计算抑制率时选择适当的参数带来了困难。针对此差异,设计了实验,探讨其可能原因,发现安瓿瓶中氧气的分布和含量是导致此差异的重要原因。由于细菌在第一指数生长期内的生长代谢是耗氧的,当氧气浓度降低到一定水平时,会激活细菌体内的两种调控蛋白,进而改变细菌氧化磷酸化电子传递链中多种电子受体酶的表达水平,细菌的代谢类型及产热也随之改变,最终导致热谱曲线的变化。 在此基础上,用安瓿法考察了氧气扩散和初始接种细菌浓度对细菌生长代谢产热的影响。实验结果表明,采用3ml安瓿瓶时,加入1ml培养基,初始接种细菌浓度为5×105cell/ml,气氛为空气时,细菌代谢热谱上各个生长期俱全,彼此区分明显,比较适于后续实验研究细菌生长状况之用。 考察了两种常用的有机溶剂N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲亚砜(DMSO)对大肠杆菌生长代谢产热的影响。实验表明,即使是微量的DMSO也能使大肠杆菌在第一指数生长期内的产热显著提高,说明DMSO对它的生长代谢有明显的刺激作用;而DMF对大肠杆菌的代谢产热影响相对较小,仅使它的生长速率常数稍微降低。加入DMF为培养基体积5%时大肠杆菌生长和代谢产热几乎不受干扰。 2.姜荆提取物对大肠杆菌和痢疾杆菌的抑制活性 采用微量热安瓿法考察了以四种不同极性的溶剂(正己烷,氯仿,乙酸乙酯和甲醇)提取姜荆得到的提取物对大肠杆菌和痢疾杆菌的抑制作用。实验结果表明,正己烷和氯仿的提取物对两种细菌的生长都没有明显的抑制作用;乙酸乙酯的提取物对两种细菌的生长表现出了一定的抑制作用;甲醇提取物对两种细菌的抑制作用最强。此外,甲醇提取物对痢疾杆菌的抑制作用(最大抑制率I=47.31%)又强于对大肠杆菌的抑制作用(最大抑制率I=29.04%)。 3.姜荆甲醇提取物的成分分离 在微量热实验测定提取物对细菌抑制活性结果的基础上,采用制备级薄层层析色谱对抗菌活性最强的甲醇提取物进行了分离。从中得到了其中含有的9个化合物。根据化合物1H-NMR、13C-NMR等结果,比照文献,对化合物进行了确认。所得化合物分别为:a-蒎烯,苎烯,桉叶素,原儿茶酸,齐墩果酸,p-谷甾醇,p-胡萝卜甙,紫花牧荆素,6’-对羟基苯甲酰五叶金花苷酸。
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