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《浙江大学》 2010年
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小鼠胚胎干细胞表面蛋白质组学研究

张佳蓉  
【摘要】:胚胎干细胞是以集落形式生长的多潜能性干细胞,具有在体外无限增殖能力和分化为所有谱系细胞的潜能,是早期发育生物学研究的理想模型和再生医学的细胞来源。研究胚胎干细胞自我更新的分子机理是胚胎干细胞研究的基本问题,胚胎干细胞的自我更新是由复杂的胞外信号和胞内调控网络共同决定的。胚胎干细胞膜表面蛋白是胞外信号与胞内调控网络的连接点,在胚胎干细胞自我更新维持中起关键作用;也是胚胎干细胞鉴别和质量控制的重要指标。系统的了解胚胎干细胞的表面蛋白特征有利于胚胎干细胞自我更新分子机理的研究和新的表面标志物的寻找。 本研究以小鼠胚胎干(mES)细胞为材料,采用EZLink-Sulfo-NHS-SS-Biotin标记细胞膜表面蛋白,纳米级的Streptavidin-LATEX亲和纯化Biotin标记的蛋白,对所得蛋白进行胶内酶解,对酶解所得肽段进行LC-MS/MS分析,建立了ES细胞膜蛋白分离分析的方法。获得3468种蛋白质,其中1699种是膜表面蛋白,得到了目前世界上最多的mES细胞膜表面蛋白质组数据。经Sosui预测软件及Swissprot和Gene Ontology数据库分析显示mES细胞的表面蛋白质组成非常复杂,包含513种信号受体和配体、295种物质转运蛋白、122种粘附和锚定蛋白等。这其中包括许多可以组成自分泌/旁分泌通路的蛋白或者介导细胞与细胞间接触依赖信号的蛋白,如Wnt/Wnt受体,IGF/IGF受体,Semaphorins/Semaphorin受体等。说明mES细胞依赖于复杂的胞外信号,胞间信号以及物质转运系统维持自我更新,保持分化潜能。 挑选五种膜表面蛋白(Tie-1、GM-CSFRα、EGFR、BMPR2和CD4),采用免疫细胞化学和流式细胞检测手段,发现其在mES细胞群体中表达是异质的,表达比例从10%到30%不等,且其表达强度有很大差异。通过对不同的mES细胞株和单细胞克隆mES细胞株的检测,证明了这些细胞膜表面蛋白在mES细胞群体中的表达比例是相对稳定的,处于一种动态平衡的状态。这说明胚胎干细胞具有亚群间的差异,亚群之间可能存在着增殖能力、分化潜能等方面的差异,mES细胞集落可能是一个协同的群体,集落中差异细胞间的相互作用是维持mES细胞自我更新与多向分化潜能的重要因素。 研究发现CD4、CD34、ILlR11, NCAM-L1、PAI-3、Tie-1等组织特异性的分化相关表面蛋白共同表达于mES细胞上,在蛋白质水平上证明了mES细胞广泛的表达分化相关的组织特异性蛋白。这为研究广泛表达对ES细胞自我更新和多潜能性的影响奠定了坚实的基础。 mES细胞的这种广泛而异质的表达组织分化相关蛋白的特征与胸腺髓质上皮细胞异位表达组织特异性基因有很强的相似性。为了探索mES细胞广泛表达的分子调控机理,我们检测并证明了胸腺髓质上皮细胞组织特异性基因表达的关键调控基因Aire在mES细胞中的表达,且其表达随着mES细胞的自发分化下降。进一步的研究表明,Aire可以调控部分ES细胞组织分化相关表面蛋白的表达,在干扰Aire的细胞中,部分组织分化相关表面蛋白的表达下降;同时干扰Aire的细胞的克隆形成率和生长速度明显下降且自我更新关键转录因子Oct-4、Nanog表达下降,说明Aire对于ES细胞的自我更新有明显影响。这一成果为探索ES细胞广泛表达组织分化相关基因的调控因子提供了新思路,也为ES细胞自我更新与多潜能性维持机理研究提供了新的方向。 综上所述,我们系统的鉴定了小鼠胚胎干细胞的膜表面蛋白质组,获得了目前最为丰富全面的mES细胞膜表面蛋白质组学数据,充分揭示了mES细胞膜表面蛋白质组的复杂性。在膜表面蛋白的水平上证明了mES细胞是异质的群体,并且证明这种异质性表达在不同的细胞株系中都存在且相对稳定。首次在蛋白质水平上证明了mmES细胞广泛表达分化相关膜表面蛋白,找到了一种mES细胞广泛表达分化相关基因的调控分子并证明了其与ES细胞自我更新能力存在功能上的联系。这可能是ES细胞自我更新与多潜能性维持机理研究一个新方向。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q813

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