收藏本站
《浙江大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

胞内海藻糖对球孢白僵菌耐热力的贡献及其代谢相关基因的功能鉴定

刘倩  
【摘要】:球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是害虫生防真菌的典型代表,其分生孢子制剂的环境稳定性是制约菌剂商品化开发和应用的关键。海藻糖是广泛存在于生物体内的抗逆保护剂,也参与真菌的抗逆境胁迫生理反应,但目前关于生防真菌中海藻糖及其代谢的生物学功能的研究报道有限。为此,本研究提出和验证了“胞内海藻糖参与耐热性”的生物学假设,并通过对海藻糖代谢途径中的中性海藻糖水解酶基因BbNTH1和6-磷酸海藻糖合成酶基因BbTPS1的克隆,将其启动子与报告基因eGFP融合表达和反义RNA干扰表达,研究了它们在多种胁迫下的转录表达情况和抗逆生物学功能。主要研究结果如下所述: 球孢白僵菌胞内海藻糖和甘露醇在热胁迫下的生理响应为了研究胞内海藻糖累积在菌株耐热性中的生理功能,将球孢白僵菌于25℃正常培养3天后进行35、37.5、40℃不同的高温胁迫1-18 h,通过测定胞内海藻糖和海藻糖水解酶活力的变化,以揭示海藻糖代谢在生防真菌中的耐热生理功能。在35、37.5和40℃下胁迫6h后,胞内累积的海藻糖含量平均值从最初的4.2分别迅速上升至88.3、74.7和65.5 mg/g菌丝,但甘露醇的含量却随胁迫温度上升和时间延长而逐渐降低。累积的海藻糖含量与海藻糖水解酶活力(r2=0.73,P0.01)和甘露醇含量(r2=0.38,P0.01)显著相关。热胁迫下胞内甘露醇含量与甘露醇脱氢酶(r2=0.41,P0.01)和1-磷酸甘露醇脱氢酶(r2=0.30,P0.01)存在显著的负相关。热胁迫后的菌落在25℃下均能恢复生长,但其生长活力取决于热胁迫温度、时间及二者的互作效应(r2=0.98,P0.01)。将菌落先置于35℃胁迫6h后再在48℃下接受更高温胁迫0-60 min后,其菌落与对照相比表现出更强的耐受力。结果显示,累积的海藻糖部分来源于甘露醇的代谢产物,由此推测甘露醇也可能参与菌株的耐热力。海藻糖水解酶可在热胁迫和恢复过程中降解海藻糖,也可能在菌株耐高温胁迫中起着重要作用。 中性海藻糖水解酶基因克隆、表达纯化及酶学特征分析从球孢白僵菌基因组中克隆到中性海藻糖水解酶基因BbNTH1,其编码蛋白是典型的真菌中性海藻糖水解酶,开放阅读框(ORF)序列长2232 bp,共有三个大小分别为50、49和58 bp的"GT…AG”内含子,编码区翻译后产生一条由743个氨基酸组成的蛋白肽段,预测分子量约为84.4 kDa。在编码蛋白的氨基酸序列中,发现一个依赖于cAMP的磷酸化作用位点(RRGS)和一个钙离子附着位点(DTDGNMQITIED).在大肠杆菌中成功表达了BbNTHl的重组蛋白,其纯化产物的最适反应温度为55℃,最适反应pH 7.0,对海藻糖具有底物专一性,米氏常数Km和Vmax分别为5.05±0.71 mM和1290.98±22.73 U/mg蛋白,降解海藻糖的催化效率(kcat/Km)为2.35x103mM-1s-1。 各种胁迫下调控BbNTHl基因表达的应激响应元件识别为了研究BbNTHl基因的上游调控序列在各种胁迫下的转录表达情况,将其上游启动子序列截短成不同长度的片段(-2713,-1912,-1060和-560 bp),与绿色荧光蛋白报告基因eGFP融合起来,在球孢白僵菌中转化表达,考察eGFP在高温、氧化和高渗透压胁迫下的表达。结果显示,在菌丝和分生孢子形成细胞中eGFP表达最强,但成熟分子孢子中表达较弱。由最短的启动子片段NthP4调控的目标基因在各种胁迫下(40℃热胁迫15-540 min;0.3-1.2 mM甲萘醌氧化胁迫;0.5~1.0 M NaCl渗透压胁迫)的转录表达水平最强。NthP4中存在的两个胁迫响应元件,不论是单个还是两个共同定点突变后,均能导致目标基因在胁迫诱导下的表达下调。这证明在不同胁迫下BbNTHl通过其上游-560 bp启动子序列片段中的两个胁迫响应元件的调控而激活其表达。 6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其生物学功能验证从球孢白僵菌基因组中克隆到6-磷酸海藻糖合成酶基因BbTPSl,通过构建含BbTPSl基因RNA干扰发夹结构和筛选标记bar基因的干扰载体在宿主菌株中进行转化表达,经Real Rime PCR筛选出表达量分别下调51.9%和77.5%的反义转化子A2和A4,对其进行了抗逆生物学表型的研究。结果发现,转化子分生孢子在没有添加营养的生理盐水中的萌发率显著低于野生菌株(F2,6=42.5,P0.01);转化子孢子耐45℃胁迫的能力显著低于野生菌株(F2,6=29.2,P0.01);在35℃胁迫下转化子胞内海藻糖的累积也显著低于野生菌株(FF2,24=3103.9,P0.01);氧化胁迫(F2,24=17.2,P0.01)和热胁迫(F2,30=52.7,P0.01)下转化子菌落活力也显著低于野生菌株。这些结果说明,海藻糖合成酶BbTPS1基因在孢子萌发、孢子耐热力及抗氧化的生理反应中发挥着重要作用。 综上所述,本研究主要成果和创新点,一是研究并建立了热胁迫下菌株胞内海藻糖和甘露醇含量及其相关代谢酶的活力变化的定量评价体系,揭示了球孢白僵菌菌落的耐热力和胞内海藻糖累积的关系。二是克隆了BbNTH1基因,发现其上游启动子最小片段NthP4对其在各种胁迫下的转录表达起关键调控作用,并从中识别出二个关键胁迫响应元件。三是克隆了BbTPSl基因,通过RNA干扰技术抑制其基因表达,证明了其对孢子萌发和耐热力及抗氧化的功能。这些结果有助于深化对丝孢类生防真菌抗逆性状及其生物学背景的认识。
【学位授予单位】:

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 靳磊;贺月林;刘红;王震;;紫外诱变选育球孢白僵菌高产菌株[J];湖南农业科学;2011年11期
2 王俊平;郑长英;;对蓟马类害虫高致病性球孢白僵菌的分离、鉴定[J];茶叶科学;2011年04期
3 李静馨;应盛华;冯明光;;通过抑制消减杂交技术分离球孢白僵菌热激响应基因[J];中国生物防治学报;2011年03期
4 朱虹;骆绪美;宋仅星;樊美珍;李增智;;球孢白僵菌对桃蚜及其两种捕食性天敌的影响[J];应用生态学报;2011年09期
5 孙明;任巧云;关贵全;刘志杰;李有全;马米玲;刘爱红;牛庆丽;杨吉飞;殷宏;罗建勋;;对蜱致病性球孢白僵菌培养条件的优化[J];微生物学通报;2011年07期
6 邓彩萍;马荣;闫喜中;;不同培养液和温度诱导球孢白僵菌BF菌株产酶特性的研究[J];新疆农业大学学报;2011年03期
7 王雅卉;郑长英;王俊平;;球孢白僵菌对西花蓟马成虫的毒力及体表侵染的扫描电镜观察[J];中国生物防治学报;2011年03期
8 何学友;蔡守平;黄金水;钟景辉;潘惠忠;周远谋;黄远清;;应用绿僵菌和白僵菌林间防治木麻黄毒蛾的初步研究[J];福建林业科技;2011年02期
9 蔡悦;张胜利;李增智;;球孢白僵菌与几种化学杀虫剂和除草剂的相容性[J];中国生物防治学报;2011年03期
10 张胜利;李增智;;球孢白僵菌对两种植物病原镰孢的拮抗作用[J];中国生物防治学报;2011年03期
11 汪黎明;陈雪;徐延平;胡晓磊;何灵敏;黄勃;李增智;;一株球孢白僵菌转基因工程菌在继代培养中的变异[J];菌物学报;2011年05期
12 许泳峰;;利用昆虫病原真菌防治蔬菜害虫[J];新农业;2011年08期
13 韦桥现;廖世纯;黎柳锋;王凤英;;5种生物农药对稻纵卷叶螟的防治效果[J];南方农业学报;2011年08期
14 宋文婧;刘振邦;朱虹;黄勃;李增智;;十种虫生真菌液体培养芽生孢子的形态发生[J];菌物学报;2011年04期
15 张龙渊;张旭晓;;我国松墨天牛生物防治研究进展[J];陕西林业科技;2011年03期
16 廖素环;张民秀;施李鸣;黄伟坚;韦英益;;类枯草杆菌蛋白酶的生物学功能及其在农牧业疾病控制中的应用[J];安徽农业科学;2011年23期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘倩;应盛华;冯明光;;杀虫真菌球孢白僵菌热激响应过程中胞内海藻糖的潜在生理功能[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
2 汤坚;丁珊;孙继美;丁贵银;李纯;;47株球孢白僵菌酯酶同工酶的初步研究[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第二卷)[C];1991年
3 丁珊;汤坚;丁贵银;孙继美;于宙;吴克;;球孢白僵菌血清学的初步研究[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第二卷)[C];1991年
4 王龙江;何余容;吕利华;;球孢白僵菌对红火蚁入侵机制的初步研究[A];第二届全国生物入侵学术研讨会论文摘要集[C];2008年
5 孙继美;汤坚;丁贵银;;球孢白僵菌多菌株间培养性状比较[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第二卷)[C];1991年
6 程素琴;周法永;;寄生于双钩跳甲的球孢白僵菌[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第二卷)[C];1991年
7 孙明;关贵全;任巧云;罗建勋;;球孢白僵菌与溴氰菊酯的协同效应及对小亚璃眼蜱的毒力测定[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
8 洪家保;徐庆丰;;球孢白僵菌在液体培养中的发育研究[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第四卷)[C];1996年
9 冯明光;;病原真菌对咀嚼式口器昆虫的摄人感染:球孢白僵菌对迁徙蚱蜢的生测实验[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第四卷)[C];1996年
10 殷凤呜;陈权才;何雪香;吕尊德;李祖文;;七株球孢白僵菌酯酶同工酶及其对马尾松毛虫的毒力测定[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第一卷)[C];1986年
中国重要报纸全文数据库 前7条
1 记者 王菲;球孢白僵菌“降伏”马铃薯甲虫[N];新疆科技报(汉);2010年
2 记者 胡左;内蒙古破解防治沙棘木蠹娥难题[N];科技日报;2007年
3 云南省农科院茶叶科学研究所 朱兴正;有机茶园病虫害防治措施[N];云南科技报;2007年
4 本报记者 严颢;“生态治虫”还真神[N];新华日报;2009年
5 广勇;如何提高生物杀虫剂的防治效果[N];湖北科技报;2003年
6 记者 庄初阳 通讯员 吴虹 潘樟胜;松阳组织开展“生态式”松毛虫防治[N];丽水日报;2011年
7 特约记者 黄耀振;19项化医产品列入江西创新项目[N];中国化工报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘倩;胞内海藻糖对球孢白僵菌耐热力的贡献及其代谢相关基因的功能鉴定[D];浙江大学;2010年
2 蒋伟;玉米海藻糖-6-磷酸合成酶基因家族的功能验证和差异表达分析[D];四川农业大学;2010年
3 王正亮;球孢白僵菌两种甘露醇脱氢酶及五种过氧化氢酶的功能分析与对鳞翅目幼虫高口服毒力的工程菌株构建[D];浙江大学;2011年
4 秦毅;表达苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aal的球孢白僵菌工程菌株的构建及其对斜纹夜蛾幼虫的肠道与体壁侵染力[D];浙江大学;2010年
5 张石柱;球孢白僵菌中疏水蛋白基因功能的研究[D];重庆大学;2010年
6 方卫国;昆虫病原真菌降解寄主体壁酶基因的克隆及球孢白僵菌高毒力重组菌株的获得[D];西南农业大学;2003年
7 谢雪钦;球孢白僵菌超氧化物岐化酶(SODs)的基因克隆、鉴定及功能分析[D];浙江大学;2010年
8 张海红;节杆菌电转化方法的优化及6-磷酸海藻糖酯酶基因的功能研究[D];兰州大学;2011年
9 罗志兵;一个功能未知基因BbAPL对球孢白僵菌气生菌丝形成的影响[D];西南大学;2008年
10 谢翎;球孢白僵菌抗逆相关功能基因克隆与基因工程菌株构建研究[D];安徽农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王晓丽;高效制备啤酒酵母细胞海藻糖的关键技术研究[D];吉林大学;2011年
2 孙召朋;继代培养对球孢白僵菌毒力及毒力相关酶表达的影响[D];吉林大学;2011年
3 张颖;利用扣囊复膜酵母菌A11菌株转化木薯淀粉生产海藻糖的研究[D];中国海洋大学;2010年
4 武增强;钙调磷酸酶催化亚基BbCNA影响球孢白僵菌产孢、毒力和毒力相关生物学性状[D];西南大学;2010年
5 孙明;蜱病原真菌的分离、鉴定及其生物学特性研究[D];甘肃农业大学;2011年
6 冷波;一种新的球孢白僵菌内切几丁质酶的纯化和抗血清的制备[D];西南农业大学;2003年
7 徐汝意;制备透性静息细胞生产海藻糖技术研究[D];山东轻工业学院;2011年
8 张晓敏;不同环境条件对球孢白僵菌菌株SJ-05的影响[D];内蒙古农业大学;2010年
9 李银平;防治蓟马的白僵菌剂型及应用技术研究[D];中国农业科学院;2012年
10 张发成;球孢白僵菌对桃蚜种群数量增长的影响[D];浙江大学;2002年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978