汞胁迫下水稻根蛋白质组学及抗性相关基因功能分析
【摘要】：Hg是植物的非必需元素,是一种对生态环境和人类健康等有着巨大危害的环境污染物质。水稻(Oryza sativa L.)不仅是世界上最重要的粮食作物,也是植物研究中的模式植物。水稻在感受各种环境因子的信号后,基因表达便会发生变化,从而引起大量的蛋白质在种类和表达量上的变化以适应不同的环境。随着蛋白质组学在功能基因组时代发挥越来越重要的作用,水稻蛋白质组学的研究逐渐掀起热潮并不断完善,已经取得了很大发展。
本研究以六叶期的汞耐性水稻突变体和中花11野生型水稻为材料,采用溶液培养的方法进行了用50μM HgCl2处理水稻根Oh和3h后的比较蛋白质组学研究,并通过功能基因在酵母中的异源表达对水稻中与Hg2+胁迫相关的蛋白(或基因)进行了功能的初步探讨,确定了它们与Hg2+耐性的相关性。主要研究结果如下：
1.以高通量的双向电泳系统为技术平台,通过改进和优化水稻根总蛋白的提取方法、等电聚焦和SDS-PAGE条件,得到了水稻根总蛋白的高分辩率和高重复性的双向电泳图谱。
2.汞耐性水稻突变体和中花11野生型在50μM HgCl2分别处理0h和3h的水稻根提取总蛋白后进行双向电泳分离,发现有29个差异蛋白点。质谱鉴定为27种蛋白,按功能可分为7大类：氧化还原平衡、信号转导、胁迫响应、代谢水平、保持细胞骨架、调节基因表达水平和未知功能蛋白。qRT-PCR实验表明大部分蛋白在基因表达水平与蛋白质表达水平并不相关。
3.利用RT-PCR技术获得了水稻翻译调控肿瘤蛋白(OsTCTP, Translationally-controlled tumor protein)、水稻丝裂原活化蛋白激酶(OsMAPK, Mitogen-activated protein kinase 2)和水稻突触小泡相关蛋白(OsKNOLLE, Syntaxin-related protein KNOLLE)基因的全长序列,通过在酵母中的异源表达分析,发现过表达这三个蛋白的酵母菌株比转有空载体的酵母菌株在Hg2+胁迫下具有更好的生活力,说明它们与Hg2+耐性存在一定的相关性。同时我们也研究了这三个蛋白与其它胁迫的关系,发现OsTCTP蛋白与Cu2+耐性存在密切关系；OsKNOLLE蛋白与盐,Cu2+,H202,Cd2+胁迫相关,其中在Cd2+胁迫下作用更明显；OsMAPK蛋白则仅与Hg2+耐性存在一定的相关性。
本研究首次利用突变体的差异蛋白质组分析了水稻根在Hg2+胁迫下的蛋白质表达变化,并首次确定了水稻TCTP蛋白和KNOLLE蛋白与Hg2+耐性相关。本实验的开展将有助于找到Hg2+耐性相关的基因或蛋白,有助于阐明植物对Hg2+的耐性机制,同时也有助于在生产上培育出具有汞抗性的水稻品种,或通过转基因技术改良其他作物的汞抗性,本项研究对我国粮食的安全、生态环境的保护及农业的可持续发展具有非常重要的意义。
【关键词】：蛋白质组学 双向电泳 Hg~(2+)胁迫 水稻根 异源表达 【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S511
【目录】：
- 目录6-8
- 摘要8-10
- Abstract10-12
- 第一章 文献综述12-29
- 第一节 重金属Hg的毒害12-16
- 1 重金属Hg污染现状和来源12
- 2 Hg对植物和人类的伤害作用12-15
- 3 植物抗(耐)Hg毒害的主要机制15-16
- 第二节 蛋白质组学研究16-27
- 1 蛋白质组学的研究技术17-25
- 2 水稻蛋白质组学在重金属方面的研究现状25-27
- 3 突变体的水稻蛋白质组研究27
- 第三节 本项目研究的意义27-29
- 第二章 汞胁迫下水稻根总蛋白高分辨率双向电泳体系建立29-41
- 第一节 材料和方法29-37
- 1 试验材料与水稻培养方法29
- 2 水稻根总蛋白提取和定量29-30
- 3 双向电泳和图像分析30-35
- 4 实验设备和试剂35-37
- 第二节 结果与分析37-38
- 第三节 讨论38-41
- 第三章 水稻根响应汞胁迫的蛋白质组研究41-62
- 第一节 材料与方法41-45
- 1 试验材料和汞胁迫处理41-42
- 2 蛋白提取和定量42
- 3 双向电泳42
- 4 染色42
- 5 胶的扫描和图像分析42
- 6 差异蛋白点的胶内酶解42-43
- 7 差异蛋白点的质谱分析及数据库检索43-44
- 8 差异蛋白点的荧光定量PCR分析44-45
- 第二节 结果与分析45-53
- 1 汞胁迫下水稻根总蛋白的双向电泳结果分析45-47
- 2 差异表达蛋白点的质谱鉴定47-51
- 3 差异表达蛋白点在基因表达水平的验证51-53
- 第三节 讨论53-61
- 1 参与氧化还原平衡的蛋白53-54
- 2 参与信号转导的蛋白54-56
- 3 胁迫响应蛋白56-57
- 4 参与维持细胞结构57-58
- 5 代谢水平蛋白58-60
- 6 调节蛋白60-61
- 第四节 本章小结61-62
- 第四章 OsTCTP、OsMAPK和OsKNOLLE在酵母中异源表达的功能分析62-81
- 第一节 材料与方法62-70
- 1 实验材料62-63
- 2 主要试剂及工具酶63
- 3 OsTCTP、OsMAPK和OsKNOLLE蛋白的结构序列分析63
- 4 OsTCTP、OsMAPK和OsKNOLLE基因的克隆63-64
- 5 OsTCTP、OsMAPK和OsKNOLLE基因的鉴定及表达载体构建64-66
- 6 酵母转化及重组子筛选66-67
- 7 OsTCTP、OsMAPK、OsKNOLLE蛋白在酿酒酵母中的功能分析及蛋白质表达水平验证67-70
- 第二节 结果与讨论70-79
- 1 OsTCTP、OsMAPK和OsKNOLLE蛋白的序列分析70-73
- 2 OsTCTP、OsMAPK和OsKNOLLE基因的克隆及酵母表达载体的构建73-74
- 3 酵母重组子的耐Hg~(2+)性检测74-79
- 第三节 本章小结79-81
- 全文结论与展望81-84
- 1 全文结论81-82
- 2 创新之处82-83
- 3 研究展望83-84
- 参考文献84-100
- 致谢100-102
- 发表文章和申请发明专利目录102-103
- 发表文章102
- 申请发明专利102-103
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