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《浙江大学》 2010年
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MK和GM-CSFRα在胚胎干细胞中的表达与功能研究

谭舟  
【摘要】:胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)是一类来源于早期囊胚内细胞团(Inner cell mass, ICM)的多能性(Pluripotency)细胞群体。ESC依赖一个复杂的调控网络维持其多能性的细胞状态。而构成这一网络的各种多能性相关分子共同决定着ESC的命运。当前已知的ESC多能性相关分子仍然十分有限,其功能研究也存在明显不足。寻找新的多能性相关分子及其功能成为胚胎干细胞基础理论研究的一个重要部分。同时ESC理论研究的深入无疑也将大大推动ESC细胞治疗和再生医学应用的发展。 中期因子(Midkine, MK)是一种分子量为13kDa的肝素结合生长因子,它在许多细胞中都有着重要的功能,包括促进细胞生长、抑制凋亡。MK最早在维甲酸(RA)诱导的小鼠胚胎癌细胞(mECC)中被发现。为了研究其在ESC中的功能,我们首先通过免疫细胞化学(ICC)和RT-PCR分析了ESC中MK的表达,并在小鼠胚胎干细胞(mESC)自发分化体系中探讨了MK随着mESC分化的表达变化。随后我们分别在有饲养层和无饲养层mESC培养体系中比较了添加和不添加MK条件下mESC自我更新能力的差异。最后我们通过Western blotting、流式细胞仪和细胞周期分析探讨了MK作用于mESC的机理。结果表明MK及其受体PTPζ在mESC和人胚胎干细胞(hESC)中均存在强阳性表达。自发分化实验进一步说明随着分化的进行,MK的表达随着mESC多能性的丢失而减弱。而外源添加高浓度的MK能有效促进mESC的增殖和集落形成,并抑制其自发分化。这一作用的产生是由于添加的MK提高了mESC胞内AKT的磷酸化水平进而活化了P13K/AKT信号通路,从而促进细胞周期由G1期向S期聚集,并减弱了mESC的自发凋亡。相反添加PI3K抑制剂LY294002有效阻断了MK对mESC自我更新的这一促进作用。因此我们认为在mESC常规培养过程中,MK通过自分泌或旁分泌促进了ESC的自我更新。这一发现首次从蛋白水平证明了MK在ESC中的表达及功能,丰富了我们有关ESC胞外因子微环境的知识。而ESC中MK/PTPζ信号通路的揭示也将进一步加深我们对多能性调控机理的认识。 抗体能识别其相应的抗原,且具有极高的特异性,因此利用单克隆抗体技术寻找新的ESC特异性功能分子无疑是多能性相关分子发现的另一条有效途径。本研究中我们通过大剂量ESC活细胞免疫新西兰大白兔,并经ICC筛选获得了305个分泌mESC阳性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,就我们所知这是目前最大的mESC特异性单克隆抗体库。从中挑选出来优先研究的20个抗体展现了不同的ICC和流式染色,说明全细胞免疫产生兔单克隆抗体可作为细胞特异性抗体产生的有效方法。这20个抗体的ICC和流式细胞分析结果显示了不同抗原在mESC中的不同表达比例,显示了这些抗原在mESC中异质性的表达规律。而从中筛选得到的一个抗体,其抗原表达随ESC的分化而降低,说明该抗原与ESC的多能性相关。进一步免疫沉淀(IP)提取抗原并经质谱鉴定表明该抗原为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体a (GM-CSFRa).这一新发现表达于ESC细胞膜表面的GM-CSFRa,其表达紧随ESC的分化而快速下降,提示了它在ESC中发挥重要功能。 ESC的理论研究为临床应用打下了基础,已有研究表明ROCK抑制剂Y-27632能有效促进单个分散hESC的存活。在我们的研究中,通过Y-27632的处理,成功诱导hESC分化为间充质干细胞(MSC)样细胞。进一步的细胞表面标志分析和分化潜能分析表明我们分化得到的hESC来源的MSC (hESC-MSC)具有成体MSC典型的细胞形态和表面标志(包括CD73、CD105、CD166阳性而CD34阴性),并能有效分化为成骨和脂肪细胞。不仅如此,我们分化得到的hESC-MSC还表现出MSC类似的免疫调节特性,能在体外的混合淋巴反应中抑制淋巴细胞增殖。在CC14诱导的小鼠肝炎症模型中,能够迁移到炎症部位并在炎症部位存活,进而抑制炎症部位的淋巴细胞浸润。我们获得的hESC-MSC在异源性免疫胜任环境中的这一独特的免疫调节能力,预示了它良好的应用前景。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q813

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