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《浙江大学》 2010年
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Gabra-3基因A至ⅠRNA编辑位点的鉴定及其分子机制的研究

田男  
【摘要】:由腺苷酸脱氨基酶(ADAR)介导的A(腺嘌呤核苷酸)至Ⅰ(次黄嘌呤核苷酸)的RNA编辑作为一种重要的转录后加工方式越来越受到人们的关注。ADAR通过自身的双链结合域识别并结合pre-mRNA形成的双链区,催化特定A脱氨基转变为Ⅰ,进而使遗传信息在RNA水平发生改变。对于蛋白编码基因,RNA编辑可能最终引起蛋白质功能的改变、增加生物体中蛋白质的多样性以及表达调控的复杂性。A至Ⅰ的RNA编辑大量发现于哺乳动物中枢神经系统的离子通道基因,γ-氨基丁酸受体就是其中之一。研究表明,ADAR1和ADAR2共同作用于小鼠GABAA基因α3亚基(Gabra-3)外显子9自身形成的RNA茎环结构,将其中一个A位点脱氨基转变为Ⅰ,密码子的改变使原先编码的异亮氨酸(Ⅰ)转变为甲硫氨酸(M),该编辑过程对小鼠GABAA受体的生物学功能有非常重要的作用。 对Gabra-3基因A至I RNA编辑的研究表明:人、小鼠、狗等哺乳动物以及鸡的I/M位点都受到编辑,而两栖纲的蛙和鱼纲的河豚鱼中此位点为组成型的G(鸟嘌呤核苷酸)。本研究为了进一步确定该位点RNA编辑发生的进化位置,对进化关系介于鸡和蛙之间的爬行纲物种蜥蜴、平嘴鳄鱼、中华乌龟,两栖纲物种东方蝾螈、墨西哥钝口螈Gabra-3基因的RNA编辑位点进行了鉴定。结果表明,三种爬行纲动物的脑组织中Gabra-3基因的I/M位点都发生了编辑,而两栖纲的东方蝾螈、墨西哥钝口螈在该位点无编辑迹象。基于以上结果我们推断:在进化史上该位点G较早出现,当两栖类分化出蛙形目和有尾目后,该位点受特定选择压力的影响发生了G至A的突变,但随后的爬行纲中产生的A至I RNA编辑在一定程度上消除了G至A突变对该基因的影响,从而维持了基因编码产物的保守性。此外,本研究还对哺乳纲、鸟纲、爬行纲各物种该位点的编辑效率进行了定量分析。结果显示,在哺乳纲到两栖纲约4.5亿年的进化历程中,该位点的编辑效率具有从高到低直至0的变化趋势。 Gabra-3基因外显子9自身形成的RNA二级结构编码16个氨基酸,是目前发现最小的受A至I RNA编辑影响的天然茎环结构,是研究RNA编辑调控机制的理想模型。本研究的另一部分内容是构建无义突变的Gabra-3迷你基因,运用T7 RNA聚合酶体外转录生成RNA分子。这些RNA分子可以形成与自然界能够发生编辑的Gabra-3相似的RNA茎环结构。利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统,我们对突变后的迷你基因I/M位点的编辑情况进行了体内检测。结果表明I/M位点周围的序列以及茎环结构都对编辑效率有显著影响。我们用RNA化学药剂结构分析法对人野生型Gabra-3迷你基因、以及突变体GC/UC、GC/CU、GC/CC的二级结构进行分析,结果表明这四个RNA分子真实的二级结构支持先前预测的最佳结构,这反映了我们基于预测二级结构提出结论的可靠性。但我们就受编辑与非编辑茎环之间的结构差异无法总结出规律用以推断I/M位点的编辑与否,鉴于此我们推测:尽管RNA分子的一级、二级结构都将影响ADARs的识别,但RNA序列在体内真实的三级构象信息可能最终决定着与ADARs是否互作。 此外,我们还设计了温度控制实验,通过改变RNA折叠温度调节最终形成的茎环结构,从而调控I/M位点的编辑。当温度升高到37℃时,原本不能被ADARs识别的GC/UC、GC/CC突变迷你基因茎环结构发生了编辑。同时,我们也证实了GC/UC、GC/CC突变迷你基因在37℃时形成的结构的确与25℃形成的不同。 我们将编辑前、后的小鼠Gabra-3全长基因与小鼠Gabraβ、Gabray共转染HEK293T细胞,使用全细胞电压钳技术记录了分别转染编辑前后小鼠Gabra-3的HEK293T细胞在γ-氨基丁酸诱导条件下的电流变化,数据表明编辑后通道激活电流的最大值变小并且γ-氨基丁酸释放后通道失活速度变快。我们推测RNA编辑通过改变GABAA受体第三跨膜结构域(TM3)上的氨基酸来影响受体构象稳定性,从而调节离子通道的开放程度。此外,RNA编辑可能在神经系统发育过程中对神经传递的类型有调节作用。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q75

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