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《浙江大学》 2011年
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TOLL样受体9在胃癌中的表达及其在发病机制中作用的研究

卢震亚  
【摘要】:胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,但对它的发病机制目前尚不十分清楚。已有研究证实病原体对人体感染导致慢性炎症,与肿瘤的发生发展密切相关。因为病原体和肿瘤细胞Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)之间的相互作用所产生的信号改变肿瘤微环境中多种细胞因子的水平,导致肿瘤的发生和调节或影响着肿瘤细胞的生存、分化、侵袭及转移。Toll样受体9(Toll-like receptor 9, TLR9)作为TLRs的主要成员之一,主要识别细菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的寡脱氧核糖核酸(CpG-oligodeoxynucleotides, CpG- ODN),已有研究证实,多种肿瘤细胞表达TLR9。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是人类胃癌的主要致病因子,1994年世界卫生组织国际癌症研究机构将H. pylori列为胃癌的Ⅰ类致癌因子,细菌本身含有致炎或致癌因子可能起了关键作用。H. pylori为一种革兰氏阴性细菌,DNA中富含有CpG-ODN,是TLR9的配体,已有研究证实,H. pylori DNA能被树突状细胞表达的TLR9识别,这些发现对H. pylori感染与胃癌发病机制的研究提供了一个新的视点。目前关于TLR9在胃癌组织中表达情况的报道甚少,其与胃癌临床病理特征的关系尚无相关研究。也有研究证实H. pylori与胃癌的发病有关,但目前无H. pylori DNA与胃癌发病机制的相关研究,我们假说由于胃组织中TLR9的表达使H. pylori通过他们的成份对胃癌的形成和发展有影响,探讨TLR9信号通路和H. pylori感染与胃癌发病机制的关系,以期为胃癌的临床治疗提供更多的理论依据。本研究分以下三部分进行研究。 第一部分Toll样受体9在胃癌组织中的表达及其临床意义 目的: 从蛋白水平研究TLR9在胃癌组织、癌旁胃组织和远癌旁胃组织中的表达情况,分析TLR9与患者的性别、胃癌进展程度、有无淋巴结转移、胃癌分化程度和临床分期等临床病理资料的相关性,探讨其与胃癌的发生、发展及临床特征之间的关系。 方法: 本研究中采用134例胃癌组织、80例癌旁胃组织和80例远癌旁胃组织作为组织芯片,采用免疫组化法检测TLR9蛋白的表达情况。同时,我们收集了36例新鲜胃癌组织及相应的癌旁胃组织和远癌旁胃组织标本,用免疫印迹法(Western blot)进一步验证TLR9蛋白的表达。 结果: 134例胃癌组织中,TLR9蛋白表达阳性104例,阴性30例,阳性率为77.6%,癌旁胃组织80例,TLR9蛋白表达阳性49例,阴性31例,阳性率为61.3%,远癌旁胃组织80例,TLR9蛋白表达阳性32例,阴性48例,阳性率为40%,胃癌组织中TLR9蛋白的表达明显高于癌旁胃组织和远癌旁胃组织(P0.05),且癌旁胃组织中的TLR9表达显著高于远癌旁胃组织(P0.05),胃癌组织中TLR9的表达与胃癌分化程度密切相关(P0.05),分化越低,恶性度越高,TLR9的表达就越低。且我们检测了8例胃癌转移的淋巴结,发现淋巴结中,转移的胃癌细胞有TLR9的表达。在36例新鲜标本中,用Western blot方法进一步证实了在胃癌组织上存在TLR9的表达,且明显高于癌旁胃组织和远癌旁胃组织。 结论: TLR9在胃癌组织中的表达明显高于癌旁胃组织和远癌旁胃组织,且TLR9的表达与肿瘤组织分化程度有关,恶性度越高,TLR9的表达就越低。 第二部分H. pylori DNA促进SGC-7901细胞Toll样受体9表达的研究 目的: 研究TLR9是否在胃癌细胞株SGC7901中表达以及用CpG-ODN和两种H. pylori(NCTC11637、NCTC12908)DNA处理后,SGC7901细胞中TLR9蛋白的表达情况。 方法: 分别用CpG-ODN和两种H. pylori(NCTC11637、NCTC12908)DNA刺激SGC7901细胞,使用流式细胞分析和Western blot对SGC7901细胞表达的TLR9蛋白进行检测。 结果: 在SGC-7901细胞中,没有CpG-ODN、H. pylori DNA刺激时,有少量TLR9蛋白表达,经CpG-ODN、H. pylori (NCTC11637、NCTC12908) DNA处理后,TLR9蛋白的表达明显增加(p0.05),且具有刺激浓度和刺激时间的依赖性。进一步发现CPG-ODN刺激组SGC-7901细胞TLR9蛋白的表达显著高于H. pylori (NCTC11637、NCTC12908)组(p0.05),两种不同的H. pyloriDNA刺激后,TLR9表达无明显差异(p0.05)。Western blot分析进一步证实SGC7901细胞经CpG-ODN、H. pylori (NCTC11637、NCTC12908) DNA处理后,TLR9表达明显增加(p0.05) 结论: SGC-7901细胞刺激前表达少量TLR9蛋白,经CpG-ODN、H. pylori DNA刺激后,SGC-7901细胞的TLR9蛋白表达显著增加。 第三部分H. pylori DNA通过TLR9通路促进SGC-7901细胞表达细胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的研究 目的: 研究H. pylori DNA是否通过TLR9通路促进SGC-7901细胞细胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的表达。 方法: 用CpG-ODN、H. pylori (NCTC11637、NCTC12908) DNA刺激SGC-7901细胞后,通过ELISA检测细胞培养上清液中细胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的表达情况,并用TLR9阻断剂Chloroquine预处理后检测SGC-7901细胞细胞因子的表达,同时应用Western blot检测了NF-κBP65、P38、P42和Akt的激活情况。 结果: 在SGC-7901细胞中,两种H. pylori DNA和CpG-ODN刺激后,均能增加细胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的表达,并具有刺激浓度和时间的依赖性;进一步发现CPG-ODN刺激组四种细胞因子的表达显著高于NCTC12908DNA刺激组(p0.05), CpG-ODN刺激组MMP9的表达显著高于NCTC11637DNA刺激组(p0.05),但TGF-β1、VEGF和MMP2的表达无显著差异(p0.05)。NCTC11637DNA刺激组TGF-β1、VEGF和MMP9三种细胞因子的表达显著高于NCTC12908DNA刺激组(p0.05),但MMP2的表达无显著性差异,(p0.05)TLR9阻断剂Chloroquine可以抑制四种细胞因子的上调表达。同时,SGC-7901细胞经H. pylori DNA和CpG-ODN刺激后,可激活NF-κB通路蛋白P65、APK通路相关蛋白p38及p42和PI3K/Akt通路相关蛋白Akt的磷酸化。 结论: CpG-ODN和H. pylori DNA通过激活胃癌细胞中的TLR9通路增加细胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的表达。该过程可能通过激活NF-κBP65、P38、P42和Akt来实现的。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R735.2

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【参考文献】
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