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《浙江大学》 2011年
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高危HPVE6/E7型内变体在宫颈癌和前体病变中的分布及其SNP芯片的研发

丁田  
【摘要】:宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤,据国际权威机构2002年统计表明,全世界每年约49.3万新发病例和27.4万死亡病例,其中80%以上发生在发展中国家。大量的研究已证实人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌及前体病变发生的必要因素,但仅有HPV感染并不能够导致宫颈癌的发生,很多的病毒和非病毒的因素影响宫颈癌的发生。其中,病毒本身因素有以下几个方面:HPV类型,HR-HPV持续感染,病毒基因编码蛋白尤其是E6/E7蛋白,最近研究还表明HR-HPV型内基因组变异与HPV持续感染和宫颈病变的进展有关。 在全世界范围内,人乳头瘤病毒16(HPV16)是宫颈癌发生的最主要病因。研究表明HPV58/52在亚洲(包括中国)妇女中是较普遍存在的亚型。基于以宫颈脱落细胞涂片为主的宫颈癌筛查的普及及推广,最近60年宫颈癌的发生率在全世界范围内有普遍下降趋势,尽管宫颈脱落细胞涂片特异性高、方法简便、且无创伤性,长期以来一直是宫颈癌筛查中唯一的初筛手段,但是细胞学筛查的敏感性较低,从而导致一部分患者被漏诊得不到早期的诊断和治疗。HR-HPV作为宫颈癌独立发病因素的事实提示,HR-HPV检测也可作为宫颈癌筛查的一种手段。尽管HPV检测的优势在于其高敏感性和高阴性预测值,但它作为初筛手段却受到其低特异性和低阳性预测值的限制。已经证实,只有HR-HPV持续感染才能导致宫颈癌及其前期病变的发生。因此,寻找一种能预测哪些HR-HPV阳性病人可能会持续感染并发展为宫颈高级别病变和宫颈癌的方法,作为HR-HPV阳性而细胞学阴性病人的分层处理,对降低随访的盲目性、提高宫颈癌筛查的效率和准确性及节约社会经济资源均有极其重要的意义。 本研究首先检测中国妇女中常见致癌亚型HPV16、HPV58、和HPV52的E6/E7基因变异情况,并分析这些变异与侵袭性宫颈癌(ICC)及宫颈上皮内瘤变(CIN)发生的相关性;然后根据不同病变之间HPV型内基因组的变异差异情况建立一种能更早期,更特异的预测宫颈高级病变或侵袭性宫颈癌的筛查方法。 目的: 了解来自浙江省宫颈癌及其前体病变妇女的HPV16/58/52 E6和E7变体的分布情况及其致癌潜能。 方法: 标本收集自2008年4月至2009年12月期间,于浙江大学医学院附属妇产科医院宫颈门诊就诊的病人,这些病人全部为HPV阳性病人,年龄为21-73岁,平均年龄38岁。共收集到2021例官颈标本,其中HPV16阳性170例,HPV58阳性177例,HPV52阳性121例。按组织病理分型包括,宫颈上皮内瘤变1级(CIN1)60例,宫颈上皮内瘤变2-3级(CIN2-3)129例,侵袭性宫颈癌(ICC)59例,正常对照220例。所有的病人都签署知情同意书。采用酚-氯仿法提取DNA之后,对这些DNA标本采用导流杂交法进行HPV分型,符合要求的DNA标本直接用型特异性引物扩增,扩增产物直接测序,NCBI在线BLAST比对结果。 结果: 1 HPV16 E6/E7变体 本研究发现HPV16亚洲种系是最常见的变体(77%),而在亚洲系中,亚洲变体与ICC及CIN有显著相关性。本研究首次发现以下新的变异体:HPV16E6(Q20P,H118Q,Q123K)和HPV16E7(D75N,T86P)。并且我们发现HPV16E6G368T变异能导致E6基因编码蛋白的提前终止,但这个变异仅存在于一例正常对照中。 2 HPV58 E6/E7变体 本研究发现了15个目前文献中尚未报道过的变异位点,其中,5个HPV58E6变异,10个HPV58E7,有意思的是,我们发现HPV58E7 C632T(T20I)和G760A(G63S)变异位点通常出现在同一标本中,并且与宫颈瘤变的程度成正相关性(Ptrend0.05)。 3 HPV52 E6/E7变体 本研究发现了14个目前文献中尚未报道过的变异位点,3个HPV52E6和11个HPV52E7变异,最常见的变异是HPV52E6 A379G(K93R), HPV52E7 C751T和A801G。 结论: 1 HPV 16/58/52 E6和E7变体在浙江省妇女中的分布与其他地区的有所不同,其中34个变异位点为本实验首次报道。 2 HPV16亚洲变体(As-V)和HPV58 E7 C632T(T20I)及G760A(G63S)变体具有更高的致癌潜能。 目的: 通过分析HR-HPVE6/E7基因型内变异在宫颈癌及其前期病变中的分布差异,定制包含差异位点的SNP芯片,以期用于宫颈癌筛查。 方法: 选取经HPV分型确定为单纯HPV16/58/18/52阳性,并通过测序(第一部分)确定包含差异SNP位点的患者标本51例做为阳性对照,这些标本共包括35个SNP位点,通过文献查阅,选择在CIN和ICC中出现频率相对高的SNP位点,与前期测序有差异的35个位点,共计70个SNP位点,设计每个点的核酸探针,定制SNP芯片。 结果: 本实验中,共设计了1689条探针,进行了4轮杂交实验,获得了四张芯片杂交结果图,包括HPV16E6混合标本和单一标本的芯片杂交结果,四种HPV类型7个基因单一标本的探针杂交结果和7个基因混合标本的探针杂交结果,发现HPVE6/E7型内基因变异芯片检测结果与基因测序结果一致,芯片杂交的重复性好,不同的HPV类型间无交叉杂交现象,但存在5%的漏诊率。 结论: 1我们研发的HPVE6/E7型内变异芯片能准确检测相距较远的单个位点的变异和同时存在的多个位点的变异,但存在5.0%左右的漏检率,尚有待进一步改进。 2 HPVE6/E7型内变异芯片具有型别特异性。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R737.33

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【参考文献】
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