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《浙江大学》 2011年
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MAPEG致炎信号通路激活与马兜铃酸Ⅰ肾毒性相关性

羊红玉  
【摘要】:第一部分:马兜铃酸I致beagle犬肾损伤时MAPEG致炎物质生成及相关蛋白表达特征 目的:探索AAI致beagle犬肾损伤时,肾脏炎症介质LTC4和PGE2生成情况及相关MAPEG家族各蛋白表达特征,并论证其对AAI所致肾脏病理改变的可能机制。 方法:健康成年beagle犬8只,雌雄各半。口服含AAI胶囊(3 mg/kg/day),对照组给予等量空胶囊,连续给药10天。每天观察动物一般状态,记录体重变化情况,并在设定时间点采集血样尿样进行分析,用于判断动物的毒性反应。动物于停药2天后,戊巴比妥钠麻醉处死。苏木素-伊红(Hernatoxylin and eosin, HE)及过碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff, PAS)染色评价肾组织各部位受损情况,透射电镜检测肾近端小管细胞的超微结构变化。采用ELISA法分别检测肾皮质和髓质内cysLTs和PGE2含量。Western blot和免疫组织化学法考察炎症介质生成相关MAPEG家族成员FLAP, mGST2、mGST3、LTC4S和mPGES-1在肾组织表达变化及分布特征,并用HPLC法检测AAI对肾微粒体LTC4合成酶系酶活力的影响。 结果:1.Beagle大连续口服AAI (3 mg/kg/day),可致体重降低,血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(crea)水平升高,出现尿蛋白,提示AAI已致肾功能损伤。Western blot结果显示,AAI引起犬肾组织凋亡终点caspase 3蛋白活化,该作用可能与AAI致肾组织线粒体Bax/Bcl-2比值升高有关。病理学检查显示,AAI对犬的肾毒性部位主要体现在肾皮质,肾近端小管,表现为肾近端小管上皮细胞肿胀、脱落,小管上皮刷状缘脱落,线粒体破坏,部分近端小管基底膜裸露。2.该剂量AAI可致犬肾皮质cysLTs水平显著升高,PGE2生成略有降低,而上述炎症介质在肾髓质变化不显著。介导以上炎症介质生成的MAPEG家族成员在肾皮质均有广泛表达但AAI对其影响程度不一,表现为LTC4S和mGST2表达的下调,FLAP和mGST3表达的上调,且FLAP, mGST3的上调主要表现在受损严重的肾近端小管上。此外鉴于未见表征mGST2参与催化LTC4特征性亚峰的形成,提示AAI主要通过上调FLAP, mGST3表达而在犬肾损伤过程中升高cysLTs水平。而对介导PGE2生成的mPGES-1表达在AAI作用后呈现下调趋势,与PGE2含量检测结果相一致。 结论: Beagle犬口服AAI (3 mg/kg/day)10天,可致肾组织与功能损伤;肾皮质是主要受损部位,而肾近端小管细胞是其主要毒性作用靶点。MAPEG家族成员FLAP和mGST3表达上调伴有cysLTs合成增加;nPGES-1表达下调,推测与PGE2生成减少减弱相关。提示MAPEG家族成员可影响炎症介质cysLTs和PGE2的生成,参与AAI介导肾毒性的产生。 第二部分:MAPEG致炎信号通路激活与马兜铃酸I致肾小管上皮细胞损伤相关性 目的:探索MAPEG家族体外介导肾近端小管上皮细胞(LLC-PK1)中两类炎症介质PGE2、cysLTs生成,及MAPK通路活化对其的调控作用,论证AAI致肾小管上皮细胞损伤的分子机制。 方法:以细胞活力和形态学改变为指标评价AAI对LLC-PKl细胞的毒性作用,JC-1染色法测定线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,△Ψm), AO/EB和DAPI染色观察细胞核损伤情况,western blot检测线粒体依赖凋亡相关蛋白变化。观察AAI对细胞MAPEG家族成员表达的时效量效关系。ELISA法检测炎症介质cysLTs生成,HPLC法检测AAI对肾微粒体LTC4合成酶系酶活力的影响,进一步探讨mGST2在cysLTs合成中的作用。并通过加入FLAP特异性抑制剂MK886,评价其对AAI致细胞损伤的保护作用。加入外源性PGE2对AAI损伤细胞活力的影响。通过考察上游信号MAPK激活的时效量效变化,并加入ERK活化特异性抑制剂U0126,评价其对AAI致细胞损伤的保护作用,Western blot方法系统评价ERK激活受抑在AAI致细胞损伤时,对MAPEG致炎信号通路的调控作用。 结果:1.AAI致LLC-PK1细胞FLAP和mGST3表达上调伴cysLTs水平增加,提示FLAP和mGST3表达与AAI致肾小管损伤存在相关性,产物cysLTs极有可能参与肾皮质损伤;LTC4S表达下调。HPLC结果未见mGST2催化LTC4生成的特征性亚峰,提示该酶未参与催化LTC4合成。选择性FLAP抑制剂MK886可减轻AAI所致细胞凋亡。2.AAI可在作用早期降低环氧合酶通路中mPGES-1表达,外源性PGE2能改善AAI所致肾近端小管细胞活力的降低。3.AAI可影响细胞活性,改变细胞形态,出现核损伤。可见在早期降低线粒体△Ψm,升高Bax/Bcl-2比值,继而增加线粒体细胞色素C的释放,激活caspase 3活化诱导凋亡。4.AAI可在早期激活细胞ERK磷酸化,抑制P38磷酸化,ERK活化抑制剂U0126可逆转AAI所致细胞凋亡,并调控炎症介质生成相关MAPEG家族蛋白在该体系中的表达。 结论: 1.AAI可上调LLC-PK1细胞cysLTs合成水平,该作用与FLAP和mGST3蛋白表达上调相平行;抑制FLAP蛋白表达可提高AAI作用后细胞的存活率,提示FLAP和mGST3蛋白表达上调及cysLTs合成增加,在AAI诱导肾近端小管细胞凋亡中起作用。 2.AAI可下调LLC-PK1细胞mPGES-1表达,提示PGE2减少可能参与AAI损伤肾近端小管。 3.AAI可经由线粒体依赖途径介导LLC-PK1细胞凋亡,抑制ERK1/2通路活化可降低AAI致LLC-PK1(?)田胞毒性作用,该作用可经由1)改善线粒体损伤;2)调控cysLTs生成相关MAPEG家族蛋白的表达;3)影响mPGES-1表达,催化炎症介质PGE2生成等来实现。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R96

【参考文献】
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