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《浙江大学》 2011年
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化学损伤剂诱导下Fen1突变小鼠癌症发生机制的研究

徐虹  
【摘要】:对各种癌症的观察分析发现,当不同的个体暴露于一定的含致癌物的环境时,他们倾向于发生癌症的程度是不同的。流行病学的研究表明在外界DNA损伤的刺激下,个体表现出的不同癌症发生倾向性可能和基因的多样性有关,如碱基切除修复(BER)相关基因的单核苷酸多态性。为了验证这个长久以来的假说,并进一步阐明参与BER途径中一个基因(Fen])的变化是如何导致机体对环境损伤剂敏感从而产生癌症,我们利用已建立的FEN1点突变(E160D)小鼠展开了一系列的实验研究,并分别从分子水平、细胞水平和小鼠模型三个层面对相关的机制进行了阐述。 1、构建了FEN1点突变库,并对重组蛋白的纯化方法进行了优化。我们沿用点突变的方法,将FEN1各氨基酸位点突变为丙氨酸,并将鉴定后的质粒和菌株保存入库。另外,我们还优化了FPLC蛋白纯化系统进而得到了极高纯度的重组蛋白,为后续的大量生化实验奠定了基础。 2、在体外分析了重组蛋白和MEF细胞(鼠胚胎纤维细胞)核粗提物对两种BER修复过程的中间产物类似物的酶切活性,发现E160D突变的存在会大大影响FEN1蛋白或相应MEF细胞对DNA损伤的切除能力。此外,我们还在体外比较了MEF细胞的BER修复能力并同时利用纯化的重组蛋白进行了LP-BER重建。对所得到的放射性产物进行信号强弱比较发现,E160D突变MEF细胞的BER活性要明显低于野生型细胞;该突变也同时影响了体外LP-BER重建的效率。 3、研究了在化学损伤剂(MNU和H202)处理情况下细胞水平的变化。E160D突变的MEF细胞对MNU和H202处理的敏感性更高,表现为其DNA复制叉的瓦解、DNA双链断裂(DSBs)的产生以及引发的染色体畸变,使细胞内非正常染色体(四倍体和非整倍体)的比例增加。 4、对基因改造小鼠进行一次性的DNA烷化剂(MNU)注射。在对照组小鼠生长完全正常的情况下,处理的小鼠表现出很高的肺癌发生率,其中尤以E160D纯合突变鼠的肿瘤恶性程度最高。 综上,我们认为BER相关基因(FEN1)的一个微小变化(点突变E160D)会导致机体对碱基损伤的修复能力下降,而当含有这种突变类型的个体处于化学损伤剂诱导的条件下,会更倾向于罹患癌症。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R730.2

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