烟草和水稻Med8及其它中介体的基因克隆和功能分析

【摘要】：中介体复合物是真核生物通用转录装置的重要组成部分,转录因子在中介体的协助下与启动子结合,从而调控基因的转录。迄今为止,对酵母中介体的结构和功能已研究得比较清楚,对哺乳动物和人中介体的研究也比较深入,但对植物中介体的研究还相对滞后。虽然中介体在酵母和多细胞动物以及植物的细胞中具有很高的结构和功能保守性,但不同物种间仍存在很大的差异。这种差异在一定程度上保持了物种遗传的稳定性与物种变化的多样性,也是物种进化的结果。 中介体亚基Med8功能的缺失导致酵母温敏性致死,也导致拟南芥叶片数增多、开花延迟等。这说明Med8具有十分重要的功能。在酵母和人类细胞中,Med8的分子机理已研究得比较清楚,但在植物中还知之甚少。因此,研究植物中Med8的分子机理十分必要,这不但有助于理解中介体复合物亚基在真核生物基因的转录调控中的作用,而且能够为作物遗传改良提供理论依据。 本研究克隆了烟草和水稻的Med8基因(分别命名为NtMed8和OsMed8),通过RNA干扰和过量表达等方法研究了Med8在烟草和水稻中的功能：通过定量PCR或Med8启动子驱动的GUS基因表达,分析了Med8在烟草和水稻中的时空表达模式；通过构建荧光蛋白的融合表达载体,研究了Med8蛋白的亚细胞定位；通过BiFC技术分析了Med8与其它中介体亚基的相互作用。主要研究结果如下： 1.NtMed8基因的克隆与功能研究 利用同源搜索,获得与拟南芥AtMed8同源的烟草EST序列,以番茄同源基因为参照序列设计引物,克隆了普通烟草NtMed8基因。测序确定NtMed8编码序列长1593 bp,编码530个氨基酸。同源搜索比对发现,Med8在植物中高度保守,分别含有酵母Med8N与Med8C相似序列。定量PCR检测野生型烟草,发现NtMed8在烟草营养器官的幼嫩组织和生殖器官里表达较强。构建了RNAi载体并转化烟草。结果表明,RNAi植株出现诸多异常：叶片数显著增加,部分叶片畸形；长日早花、短日晚花；雄性不育,花粉变大,虽可被KI-I2溶液染色但几乎不萌发；叶片表皮细胞、叶肉细胞、叶绿体皆变大,气孔密度下降,花器官变大,等等。 2.烟草和水稻几个中介体亚基的亚细胞定位和表达谱分析 利用同源搜索和EST序列拼接,克隆了烟草中介体亚基基因NtMed18、NtMed6和NtMed21,构建了35S启动子驱动的与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和增强型黄色荧光蛋白(EYFP)基因的融合表达载体,利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达进行亚细胞定位分析。结果表明,NtMed8、NtMed18、NtMed6和NtMed21定位在细胞核和细胞质内,但主要在细胞核里。同源克隆了水稻中介体亚基基因OsMed6、OsMed8和OsMed22,构建了玉米ubiquitin启动子驱动的EYFP基因的融合表达载体,转化烟草叶片进行亚细胞定位分析。结果表明,OsMed6特异地定位在细胞核内；OsMed8定位在细胞核与细胞质内,但主要在细胞核内；OsMed22特异地在细胞壁处成段分布,其亚细胞定位有待于进一步确认。同时,利用现有的基因芯片数据,对水稻23个推测的中介体亚基基因在21中组织中的表达谱进行了聚类分析。结果表明,23个中介体亚基中,OsMed12的表达组织特异性最强,其次为OsMed11,其它21个亚基基因表达无明显规律,较接近组成型表达。OsMed15在检测的各个组织中(除了受精后6天的胚乳)都有较强表达,OsMed10在21个组织中整体表达较弱。OsMed12、OsMed11、OsMed28、OsMed31、OsMed17、OsMedl8和OsMedl9b是把21个组织分成4组的过程中起关键作用的7个基因。 3.NtMed8与其它亚基的互作分析 为了证实同源克隆的NtMed8属于烟草中介体亚基,同时研究NtMed8与其它亚基的相互作用,构建了35S驱动的含有EYFPN-端1-173氨基酸编码序列标签的融合表达载体(pNYE和pNeYE)以及含有EYFP C-端151-238氨基酸编码序列标签的融合表达载体(pCYE和pCeYE)。把NtMed8、NtMed18、NtMed6和NtMed21的全长ORF亚克隆到相应的载体上,获得N端和C端分别含有不同EYFP片段的融合表达载体,转化农杆菌后,把不同的菌液1：1混合,共转化烟草叶片,72 h后在共聚焦显微镜下观察荧光。结果表明,NtMed8与NtMed18存在互作,与酵母中介体亚基的互作关系一致。同时,还观察到NtMed8与NtMed6和NtMed21的互作以及NtMed18与NtMed6的互作。 4. OsMed8功能的初步研究 为了研究Med8在水稻中的时空表达与功能,构建了OsMed8启动子驱动的GUS表达载体以及OsMed8的过量表达载体和RNAi载体,以农杆菌介导法转化水稻品种中花15。结果表明,在各个组织都能检测到GUS基因的农达,主要在营养生长和生殖生长较旺盛的部位染色较强,包括侧根原基、子房和雌蕊基部、初分化的小穗、幼嫩茎等。过量表达OsMed8导致水稻早花、稻穗变长、穗粒数增多,而RNA干扰则导致水稻晚花、穗粒数减少和雄性育性降低等。