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《浙江大学》 2011年
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DDT降解质粒pDOD及其对土壤中残留DDTs降解的生物强化

高春明  
【摘要】:DDT作为一种高效有机氯农药(Organochlorine pesticides, OCPs),在我国曾大量用于农田害虫防治与公共卫生方面,是一种典型的持久性有机污染物(Persistent organic pollutangts, POPs)。虽然我国自1983年开始逐步禁用,但因其化学结构稳定,不易降解,国内很多地区仍有不同程度的DDT残留检出,存在一定的生态风险。 本文调查分析了浙江省某地DDT残留状况及其来源,在确定DDT降解菌Sphingobacterium sp. DDT-6降解功能位于质粒pDOD的基础上,通过gfp标记获得质粒pDOD-gfp,研究了pDOD在土壤中的转移及其对DDT降解的促进作用、质粒pDOD供体菌在DDT污染土壤中的生物强化作用,建立了一种基于质粒转移的土壤DDT降解生物强化技术途径。主要研究结果如下: (1)对浙江省某地进行了DDT残留调查,61个取样点土壤样品中DDT的检出率为100%,p,p'-DDT、p,p'-DDE、o,p'-DDT、p,p'-DDD残留量的平均值占DDT总量的百分比分别为:56.1%、34.4%、6.88%和2.41%。采用样品土壤中o,p'-DDT与p,p'-DDT比值Rs判断DDT污染的来源,结果显示该调查地区的残留DDT主要源于DDT禁用前的长期大量使用。 (2)DDT降解细菌Sphingobacterium sp. DDT-6经质粒消除后失去降解能力,质粒消除的Sphingobacterium sp. DDT-6-经质粒回复后重新获得降解能力,由Sphingobacterium sp. DDT-6提取质粒并转入E. coli TGⅠ获得的转化子具有对DDT的降解力,证明DDT降解细菌Sphingobacterium sp. DDT-6降解功能位于质粒pDOD,其大小约为20kb。 (3) Sphingobacterium sp. DDT-6、E. coli DH5α(pZP201-gfp)及E. coliHB101(pRK2013)三亲杂交经抗性检测、荧光标记、质粒检测和降解功能试验筛选获得Sphingobacterium sp. DDT-6 (pDOD-gfp),提取标记质粒pDOD-gfp转化E. coli TGⅠ和Klebsiella sp. TZ获得质粒供体菌E. coli TGⅠ(pDOD-gfp)和Klebsiella sp. TZ (pDOD-gfp),以Sphingobacterium sp. DDT-6 (pDOD-gfp)、E. coli TGⅠ(pDOD-gfp)、Klebsiella sp. TZ (pDOD-gfp)和质粒pDOD-gfp接种土壤可显著提高土壤中DDT的降解和降解菌数量。从接种pDOD-gfp处理120d土壤中分离到一株具荧光特性、含pDOD的DDT降解菌纤维单胞菌(Cellulomonas sp.)ZYG2,说明pDOD-gfp接种土壤后降解质粒转入土壤细菌、增加土壤中DDT降解菌数量,从而提高DDT降解速率。 (4)以E. coli TG I (pDOD-gfp)为质粒供体菌研究了温度、湿度和土壤性质对其强化DDT降解作用的影响,结果表明:20℃、30℃、40℃培养条件下120d的DDT降解率分别为63.2%、70.0%、61.6%;土壤含水量为田间最大持水量的40%、60%、80%的培养条件下120d DDT的降解率分别为60.7%、65.3%、54.4%;120d华家池潮土、萧山海涂土、嘉兴青紫泥和金华红壤培养DDT的降解率分别为65.0%、63.5%、61.6%、60.1%。30℃、土壤含水量为田间最大持水量的60%的华家池潮土培养是E. coli TG I (pDOD-gfp)为质粒供体菌强化对DDT降解的适合条件。 (5)以Sphingobacterium sp. DDT-6、Sphingobacterium sp. DDT-6 (pDOD-gfp)、E.coli TG I (pDOD-gfp)为质粒供体菌制备降解功能菌剂,于浙江省某地进行DDT污染土壤修复试验,210d后对照处理土壤中DDT的降解率为16.2%, Sphingobacterium sp. DDT-6 Sphingobacterium sp. DDT-6 (pDOD-gfp)、E. coli TG I (pDOD-gfp)处理土壤中DDT的降解速率大幅提高,降解率分别为46.5%、52.0%和50.7%。同期运用PCR-TGGE研究了修复过程中土壤微生物群落结构多样性的变化,主成分分析的数据显示,对照处理与喷施质粒供体菌Sphingobacterium sp. DDT-6、Sphingobacterium sp. DDT-6 (pDOD-gfp)、E. coli TG I (pDOD-gfp)处理土壤样品在成分分析坐标系上的坐标聚于一簇,说明质粒供体菌的喷施未明显改变土壤微生物群落结构,180d至210dSphingobacterium sp. DDT-6(pDOD-gfp)处理土壤样品TGGE电泳图显示3条条带比其他处理略亮,说明某些土壤微生物种群数量上有所增加。
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