不同培养条件对产毒铜绿微囊藻和不产毒铜绿微囊藻生长竞争的影响
【摘要】：铜绿微囊藻是水华时的优势藻种,铜绿微囊藻可分为产毒铜绿微囊藻和不产毒铜绿微囊藻,不同的环境条件可以影响这两种藻的竞争关系。本文对比并选择了一种最佳的铜绿微囊藻DNA提取方法并据此建立一套测定水中产毒和不产毒铜绿微囊藻浓度的实时荧光定量PCR方法,应用该方法检测混合培养液中两张藻量,通过PB设计和CCD设计考察了光照、温度、pH、硝态氮离子浓度、P离子浓度这五个因素对产毒/不产毒铜绿微囊藻生长竞争的综合影响。全文研究内容和实验结果如下：
(1)分别对比了SDS裂解法、DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒、CTAB提取法提取铜绿微囊藻DNA的效果,结果表明采用DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒提取DNA具有很好的重复性,提取效率稳定；SDS裂解法也能有效提取铜绿微囊藻的DNA,但是重复性略差；CTAB法在提取样品DNA时发生了降解。
(2)分别用SDS裂解法和DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒提取不产毒铜绿微囊藻标准品的DNA并建立标准曲线。结果表明采用DNeasy Blood TissueKit试剂盒提取的标准品DNA具有很好的重复性,采用该方法提取的标准品DNA经PCR扩增后可以建立相关性很好的标准曲线用于产毒和不产毒铜绿微囊藻浓度的定量检测。
(3)应用实时荧光定量PCR检测混合培养液中的产毒铜绿微囊藻和不产毒铜绿微囊藻的细胞浓度,通过PB设计在光照、温度、pH、硝态氮离子浓度、P离子浓度这五个因素中根据影响显著性分析筛选出光照、硝态氮离子浓度、温度这三个影响因子,然后采用中心组合实验设计法对这三个影响因子进行3因素5水平的组合实验设计,实验结果经RSM拟合,显示在混合培养初期,不产毒铜绿微囊藻很快能占据优势,而较强的光照强度和较高的硝态N离子浓度促进产毒铜绿微囊藻在混合培养中的竞争生长能力。
【关键词】：DNA提取 实时荧光定量PCR 竞争培养 产毒铜绿微囊藻 不产毒铜绿微囊藻 【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X173
【目录】：
- 致谢4-5
- 前言5-6
- 课题来源5
- 研究意义5-6
- 摘要6-7
- Abstract7-9
- 目录9-11
- 1 绪论11-19
- 1.1 蓝藻水华问题11-12
- 1.2 传统的铜绿微囊藻检测技术12-15
- 1.3 分子生物学检测方法15-18
- 1.4 研究目标与内容18-19
- 2 实验材料与实验方法19-23
- 2.1 材料与装置19-21
- 2.1.1 实验试剂19
- 2.1.2 实验设备和仪器19-20
- 2.1.3 藻种来源及培养基配制20-21
- 2.2 测试方法21-23
- 2.2.1 血球计数板法21
- 2.2.2 DNA纯度和浓度计算方法21
- 2.2.3 凝胶电泳方法21-23
- 3 不同DNA提取方法提取铜绿微囊藻DNA效果的对比研究23-29
- 3.1 引言23-24
- 3.2 材料与方法24-25
- 3.2.1 DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒操作步骤24
- 3.2.2 溶菌酶-SDS裂解法提取DNA方法24-25
- 3.2.3 CTAB提取法25
- 3.2.4 DNA样品的检测25
- 3.3 结果与讨论25-29
- 3.3.1 三种DNA提取方法对比25-26
- 3.3.2 SDS裂解法和试剂盒法提取纯度、浓度对比26-27
- 3.3.3 试剂盒法提取4种藻种电泳图谱27-29
- 4 检测产毒/不产毒铜绿微囊藻浓度的定量PCR方法的建立29-36
- 4.1 引言29
- 4.2 材料与方法29-31
- 4.2.1 DNA提取方法29
- 4.2.2 标准品的配制29-30
- 4.2.3 引物设计30
- 4.2.4 定量PCR反应程序30-31
- 4.3 结果与讨论31-36
- 4.3.1 试剂盒法和SDS裂解法所做标准曲线对比31-33
- 4.3.2 检测产毒铜绿微囊藻的标准曲线33
- 4.3.3 检测不产毒铜绿微囊藻的标准曲线33-36
- 5 RSM优化法研究不同培养条件对产毒/不产毒铜绿微囊藻生长竞争的影响36-46
- 5.1 引言36-37
- 5.2 材料与方法37-38
- 5.2.1 PB设计37-38
- 5.2.2 CCD设计38
- 5.3 结果与讨论38-46
- 5.3.1 PB设计结果分析38-39
- 5.3.2 响应值拟合及模型分析39-46
- 6 结论与建议46-48
- 6.1 结论46
- 6.2 创新点46-47
- 6.3 建议与展望47-48
- 参考文献48-52
- 攻读学位期间发表的与论文内容相关的学术论文52
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