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《浙江大学》 2012年
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黑斑侧褶蛙SSR位点分离及种群遗传结构分析

龚杰  
【摘要】:广域分布的两栖类无尾目动物,一直被视为分子支系地理学研究的模式物种。近年来,两栖类全球性的衰退问题已引起广泛关注。作为我国分布最广、数目最多的两栖类动物——黑斑侧褶蛙(Pelophylax nigromaculatus,简称黑斑侧褶蛙),也如同其他许多两栖类动物一样,正处于严重的衰退中。为此,本文在筛选SSR以建立检测标记,并配合使用线粒体控制区标记,对黑斑侧褶蛙的群体检测,分析种群的遗传结构特征,以期为相关领域开展黑斑侧褶蛙及其近缘类群衰退问题的研究,提供有用的信息。本研究主要结果如下: (1)以磁珠富集法筛选了13个多态的微卫星座位(Rnh1~Rnh13),自浙江金华的35个黑斑侧褶蛙个体检测到的等位基因值为3-14,观察杂合度和期望杂合度分别为0.171-0.941和0.422-0.912。各位点多态信息含量为0.341-0.891,位点累计的个体识别率达到0.9999。 (2)以古北区区域内23个种群的321个个体的样品为材料,通过线粒体D-loop区约630bp的序列分析,定义了114个单倍型,并基于邻接法(neighbor joining, NJ)将这些单倍型分为两个明显的支系,依据其分布的地域命名为:中原支系和东北支系。除长白山脉一带的黑斑侧褶蛙种群属于东北支系外,其余中国境内的古北区黑斑侧褶蛙皆属于中原支系。其中,中原支系的在Bayes树、NeighborNet网络、Median-joining网络中都大致可以分为两支。这两支的分布基本是重叠的,这可能暗示着中原支系在扩散初期就存在着多态的祖先单倍型。 (3)按照无尾目物种线粒体控制区的普遍进化速率(3.5% per million years),可推算出中原支系群体和东北支系群体分别在约0.070MYA和0.025MYA经历了种群扩张事件。这两个时间都处于第四纪的更新世。这暗示,黑斑侧褶蛙的群体扩张事件,可能与第四纪晚期的气候变化存在联系。但由于缺乏近缘物种的化石校正点,因此在具体的时间上,可能存在一些出入。 (4)与线粒体的分析结果一样,基于微卫星座位数据的STRUCTURE分析将群体聚为中原支系和东北支系两支。另外,发现还一个位点仅在中原支系中扩增,这再次暗示了两个支系之间遗传分化。但由于缺乏其他分子标记的证据(特别是适应性的分子标记),两个支系是否能构成显著进化单元,仍有待于进一步的讨论。其中,东北支系的相关种群基于微卫星STRUCTURE分析又被明确地分为两组,这可能由于长白山脉的地理阻隔有关。但在线粒体方面,这两组群体并无明确分化,这可能是由于微卫星具备更高的分辨率,又或者可能与偏性扩散有关。 (5)用mantel test检测遗传分化和地理距离之间的关系发现:如果把两个支系视为一个整体,则遗传分化与地理距离之间无明显的相关性(P值分别为0.462和0.280)。这可能是主要是由于两个支系缺乏基因交流造成的。 而如果将两个支系分开考虑:中原支系无论在微卫星标记和线粒体标记上,都表现出了遗传分化与地理距离的显著正相关性(相关系数分别0.561和0.265,P值分别为0.001和0.015)。这可能是因为中原支系在古北区内主要分布于华北平原和东北平原,并不存在阻隔基因流的特殊因素,所以地理距离成了种群之间最主要的隔离因素。所以,邻近的种群之间可能依然存在一定的基因交流,这点在STRUCTURE分析的结果中也得到了验证。而东北支系则在两套标记上都表现为相关性并不显著(P值分别为0.552和0.160)。这说明地理因素并非东北支系各种群之间产生遗传隔离的主要原因。从STRUCTURE分析的结果中可知,东北支系的种群分为两支,这两支之间有长白山脉阻隔。综上可知,至少对于黑斑侧褶蛙而言,地形因素是影响遗传格局的重要因素 (6)对从微卫星标记和线粒体标记中的所得的数据进行遗传多态性分析。发现无论是微卫星标记,还是线粒体标记,中原支系群体都比东北支系群体表现出了更高的遗传多态性。在线粒体标记方面,中原支系群体的单倍型多态性和核苷酸多态性分别为0.958和0.01268,而东北支系群体分别对应为0.859和0.00492。在微卫星标记方面,中原支系群体的有效等位基因数目、等位基因丰富度、观察杂合度分别为5.451、9.29、0.676、0.734,而东北支系群体对应为1.883、4.45、0.342、0.367。就中原支系群体而言,古北区的种群在微卫星标记和线粒体标记方面,都表现出了“南高北低”格局的遗传多样性。而在东北支系群体中,毗邻于朝鲜半岛的种群具有更高的遗传多样性。这种遗传格局可能和冰期后的种群扩散有关。 (7)通过对各地种群进行近期瓶颈效应的检测,发现存在多个种群经历了显著的的近期瓶颈效应。这些近期经历了瓶颈效应的种群,并不连成区域,邻近的种群常表现不同情况。而且近期经历了瓶颈效应的种群,从南到北都有零散分布。这暗示,黑斑侧褶蛙种群衰退的主因可能并非是流行性疾病或全球气候变化,而是人为捕杀或生境破坏。因为由疾病或气候变化引起来的两栖类种群衰退,通常表现为区域性种群全面衰退。而这个结果也与宏观调查的结论相符合。
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