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《浙江大学》 2011年
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害虫生防真菌多药抗性与侵染褐飞虱的高毒力菌株筛选策略研究

宋婷婷  
【摘要】:昆虫病原真菌是害虫微生物防治的重要资源,其制剂被广泛用于农林害虫防治。生防菌剂的杀虫效果不仅仅取决于生产菌株的遗传特性,更受到各种环境胁迫因素的影响,用于植物病害防治的各类真菌杀菌剂的存在是影响生防菌剂在田间应用效果的重要胁迫因素之一。因此,探索生防真菌对药物胁迫的内在保护机制,通过遗传改良.提高生产菌株的抗药性,对于提高生防菌剂的田间效果和稳定性具有重要意义。ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter proteins)是很多生物体内存在的的药物转运蛋白,是保护细胞免受杀菌剂伤害的重要作用机制之一。但是,这一重要的抗药机制在昆虫病原真菌中的研究报道仍处于空白状态。 本研究以生防真菌过寄主对后分生孢子表面理化特征的变化与毒力的相关性研究为起点,重点研究生防真菌对多菌灵的抗性机制。利用基因差异表达谱,分析了球孢白僵菌中可能存在多菌灵抗性相关的其它机制,由此提出新发现的转运蛋白编码基因在生防真菌多药抗药性中可能起重要作用的假设。在此基础上,以球孢白僵菌作为研究对象对已知的转运蛋白进行了实时定量PCR分析,获得了一些作用比较明显的药物转运蛋白及上游的控制元件。通过农杆菌介导法进行相关基因的敲除及表型分析,较好地证明了上述假设。利用化学诱变的方法,通过对玫烟棒束孢Isaria fumosorosea(同物异名为玫烟色拟青霉Paecilomyces fumosoroseus)的多菌灵抗性菌株的基因突变位点和基因表达的分析,发现在棒束孢抗性菌株产生了多药抗药性,这不同于球孢白僵菌(Beauveria bassiana)对多菌灵的抗性主要基于p-微管蛋白的关键点位突变,进一步证明了多药抗药性机制在生防真菌中存在的普遍性,论文主要内容和结果如下: 球孢白僵菌过寄主改变孢子表面性状并提高对褐飞虱的毒力褐飞虱是主要水稻害虫,严重威胁水稻生产。在用不同寄主和地理来源的21株球孢白僵菌对褐飞虱三龄若虫进行高浓度的生物测定中,若虫死亡率仅有2%-23%。将各菌株连续过寄主后进行同样的生物测定,其中的三个菌株过寄主二次后,对三龄若虫的致死率提高到50%以上,再过寄主则不再提高侵染力;而其余菌株过寄主后侵染力无明显变化。通过对历次过寄主后菌株分生孢子表面疏水力zeta电位(Pz)和蛋白酶Prl活力(Ap)的测定结果,显示在三株菌中这些性状的变化与过寄主的次数(N相关。多变量线性相关分析显示,N、Hr和Pz对毒力升高的贡献率达89%。显著的线性相关还分别包括Hr与N(r2=0.64)、Pz与N(r2=0.52)、Ap与N(r2=0.51)、Hr与Ap(r2=0.45)及Pz与Ap(r2=0.57)之间。这些结果说明,Hr、Pz等分生孢子表面理化特性的改变,关系到菌株对异源寄主体壁附着的适应性,因而可作为生防菌株筛选的可测性理化指标。 球孢白僵菌抗多菌灵菌株的基因表达谱分析对野生株Bb2860和多菌灵高抗的两株球孢白僵菌(2860-M2-6和2860-M2-11)在含和不含MBC200μg/mL的SDAY平板菌落中的基因表达进行两两比较的差异分析,最终两组数据的交集获得了144个与多菌灵抗性相关的上调基因。将基因利用R统计学语言进行聚类分析,并根据其代谢途径和功能将这144个基因分为五大类,从中挑选了5个转录因子、5个信号转导激酶和2个转运蛋白基因,用实时定量PCR检测12个基因的转录表达水平,证明表达谱数据的可靠性,即它们的高表达与多菌灵抗性密切相关,显示球孢白僵菌可能存在多样的多菌灵抗性机制。其中,新发现的两个药物转运蛋白可能在多菌灵抗性中扮演重要角色,在后续实验中对其进行更深入的分析。 球孢白僵菌转运蛋白基因的功能分析从球孢白僵菌基因组中找到12个药物转运相关蛋白的基因序列,分属于三个家族:多向抗药性(PDR)基因6个、多药抗药性(MDR)基因5个和多药抗药性关联(MRP)基因1个。在MBC、嘧菌酯(ASB)和草丁膦(PPT)三种药物不同时间的诱导条件下,用实时定量PCR方法测定各基因的转表达水平,发现2个PDR基因和1个MDR基因的表达量上调显著。将此3个基因(BbABC1、 BbABC2及BbMDR1)与差异表达谱中获得的2个转运蛋白基因(BbABC5、BbMRP)进行单基因敲除和表型分析,结果显示,敲除株ABbABC1、ΔBbABC2、ΔBbABC5、ΔBbMDR1和ΔBMRP对9种结构不相关的化学药物(杀菌剂8种和刚果红)的敏感度差异很大,多表现为抗药性下调,也存在抗药性不变或上调的表型。五个敲除株对双氧水和甲萘醌诱导的氧化胁迫的耐受力都表现为下调趋势,但下调程度不同。ΔBbABC1、ΔBbABC2和ΔBbMDR1对斜纹夜蛾二龄幼虫的毒力测定显示,ΔBbABC1和ΔBbMDRl毒力显著下降而ΔBbABCl无显著下降,说明BbABC1和BbMDR1是可能的毒力相关因子。由此证明,药物转运蛋白的表达量在很大程度上决定球孢白僵菌的抗药性,有的转运蛋白还影响毒力。 球孢白僵菌转运蛋白调控因子Bbgal的克隆与分析比较在真核细胞中存在转录调控激活元件(PXR或Gall1p),这样的小分子蛋白可与异源药物结合上调多种ABC转运蛋白的表达。通过基因比对分析,在白僵菌基因组中获得一个与已知Gall1p蛋白基因类似的基因(Bbgal)。根据实时定量PCR测定,在MBC、ASB和PPT药物诱导条件下该基因在球孢白僵菌中的转录表达水平均上调。将该基因敲除后进行表型分析,证明Bbgal的功能与酵母Gall1基因的功能相似。敲除株ΔBbgal对10种结构不相关的化学物质(杀菌剂9种和刚果红)的抗性,大多表现为显著下调,唯一例外是对ASB的抗性不变。该敲除株菌落生长对双氧水和甲萘醌氧化胁迫响应的方向相反,分别为显著上调和下调;对斜纹夜蛾二龄幼虫的毒力较野生株显著下降。由此暗示,作为转录激活因子的Bbgal,可能通过与进入细胞的异源物质(药物)结合而调控球孢白僵菌中药物转运蛋白的表达,从而影响该菌的抗药性和毒力。 玫烟棒束孢多菌灵抗性菌株的诱变及相关基因分析为了探讨棒束孢对多菌灵(二甲基苯丙咪唑氨基甲酸,MBC)抗性的可能机制,将一个对多菌灵敏感的野生菌株If116(MBC EC50:1.67μg/mL)在含有多菌灵的平板上进行化学诱突,获得9个抗药性巨幅提高(MBC EC50:99.4至1000μg/mL以上)但耐高温胁迫能力显著降低的突变株。遗传连锁分析表明,所有抗性菌株的α-和β-微管蛋白基因不存在已知的多菌灵抗性增强的点突变。根据罗丹明荧光染料色和细胞流式测定,发现多菌灵与罗丹明在If116细胞的排出中存在竞争抑制,显示染料泵出可能涉及多向抗药性pleiotropic drug resistance (PDR)有关的ABC转运蛋白。为了进一步阐明高抗多菌灵突变株中ABC转运蛋白的可能作用,从野生株和9个突变株中克隆出了同一编码ABC转运蛋白的基因ifT1及其上游序列。通过基因序列比对分析,发现所有突变株ifT1基因编码区不存在任何点突变,但其上游启动子区均有3个转录因子的重要结合位点发生了相同的点突变,即-2202G→A、-836C→T和-300C→T。实时定量PCR分析表明,野生株ifT1的转录表达水平随多菌灵浓度增加而被诱导性提高,而9个突变株中的ifTl表达水平比野生株高出17~137倍。由此推测,启动子区域3个公共点突变可能是导致ifT1基因在突变株中过量表达、使ABC药物转运蛋白积累增多而致突变株高抗性产生。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S476

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【引证文献】
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