收藏本站
《浙江大学》 2012年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

基因工程菌E.coli pET28a(+)-PAW的构建及其转化废弃物产生物柴油的研究

王兵  
【摘要】:近年来,生物柴油作为一种可再生,无毒可降解的新能源,逐渐成为了人们的研究热点。它是由油酸、亚油酸等长链饱和或不饱和脂肪酸,同甲醇或乙醇形成的脂肪酸甲酯(fatty acid methyl esters, FAMEs)或脂肪酸乙酯(1(atty acid ethyl esters, FAEEs)类化合物。现在世界上95%的生物柴油原料来自动植物油脂,使得生物柴油的价格是石化柴油的1.5倍,寻求新的廉价易得的原料降低生物柴油的成本是形势所趋。利用微生物合成生物柴油的方法与工业化生产生物柴油的化学催化法相比,不仅在生产过程中更加清洁无环境污染,而且可以通过对微生物进行基因工程改造,使其合成更符合人类需要的生物柴油成分。因此,利用基因工程菌发酵生产生物柴油具有重要的现实意义。 本文的主要研究结果如下: (1)产生物柴油的基因工程菌构建 利用基因工程手段,从Zymomonas mobilis中扩增得到丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase, pdc)和乙醇脱氢酶(alcohol dehydeogenase Ⅱ, adh)两个基因,从Acinetobacter baylyi ADPl (BD413)中扩增得到蜡酯合成酶/二酰基甘油转移酶(wax ester synthase/acyl-coenzyme A:diacylglycerol acyltransferase, atfA)基因。利用重叠延伸PCR技术扩增获得含pdc和adh两个基因的可以产乙醇的片段PA,和含有PA和atfA基因的片段PAW。在融合基因PA的引物设计中,通过去除pdc片段末端的TAA终止密码子,使pdc和adh两个基因共用一个T7启动子,并在pdc和adh两个基因中间加入一段Linker,使形成的融合蛋白PA能够正确折叠,保证PA融合蛋白具有自身的催化活性。PAW蛋白中的两个基因各自带有一个T7启动子。经相关的分子克隆技术,成功获得工程菌E. coli pET28a (+)-PAW。经SDS-PAGE凝胶电泳分析和酶活测定,证明该工程菌可以有效表达外源蛋白。 (2)工程菌发酵生产生物柴油的条件探究 将工程菌E coli pET28a(+)-PAW接入含有外源脂肪酸和糖类的LB发酵培养基中,能产生乙醇和多种脂肪酸乙酯。结果显示,培养基中的添加木糖有利于工程菌细胞内生物柴油脂滴的积累,添加葡萄糖有利于工程菌发酵生产乙醇。当发酵培养基中添加2%葡萄糖时,得到最大乙醇含量8.12gl-1和1.81gl-1脂肪酸乙酯,脂肪酸乙酯占细胞干重的62%。当发酵培养基中添加2%木糖时,共得到3.73gl-1乙醇和最大脂肪酸乙酯含量2.79gl-1,脂肪酸乙酯占细胞干重的82.2%,透射电子显微镜可清晰观察到菌体细胞内形成的脂滴。 (3)工程菌利用餐饮泔水生产生物柴油的研究 以餐饮泔水为脂肪酸替代物,工程菌能利用餐饮泔水产生生物柴油。当餐饮泔水中不添加任何糖类物质发酵生产生物柴油时,FAEEs的含量最低,为0.047gl-1,乙醇的产量为1.05gl-1。当单独添加2%的木糖至泔水培养基中时,得到最大脂肪酸乙酯的含量0.249gl-1。木糖有利于菌体积累脂肪酸乙酯,这一结果与在LB培养基中的发现一致。通过Pearson相关性分析,发现乙醇产量与基质中糖量呈正相关(R=0.844,p=0.017)。同时通过三个非线性回归方程表明葡萄糖浓度不仅比木糖更利于糖的利用,也利于乙醇的生产,木糖有利于脂肪酸乙酯的生产。GC/MS分析显示餐饮泔水中大部分的脂肪酸经工程菌发酵后转化得到相应的酯化物,所得到的生物柴油的冷滤点在-5℃到-10℃之间,性能较好,能够在低温环境中应用。 (4)工程菌利用秸秆水解液生产生物柴油的研究 三种不同秸秆成分的分析显示,玉米中纤维素含量最高(49.20%),其次为水稻(46.64%)、小麦(44.13%);三种秸秆中半纤维素含量从大到小依次为玉米(20.92%)、小麦(20.74%)、水稻(17.08%)。秸秆水解液的HPLC分析表明玉米水解液中葡萄糖含量(10.40gl-1)大于水稻(7.93gl-1)和小麦水解液的葡萄糖含量(4.55gl-1);小麦水解液中木糖含量(40.56gl-1)依次大于玉米(37.15gl-1)和水稻水解液中木糖含量(31.23gl-1)。当工程菌E. coli pET28a (+)-PAW以小麦,玉米和水稻三种秸秆的水解液为糖类替代物发酵生产生物柴油时,小麦水解液培养基中合成的生物柴油量(0.30gl-1)高于玉米水解液培养基中的含量(0.25gl-1)和水稻水解液培养中的含量(0.19gl-1)。小麦水解液培养基较另外两种水解液更适合发酵生产生物柴油。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:TE667

【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 范丽苹;生物柴油基因工程菌的构建[D];北京化工大学;2013年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王成;刘忠义;陈于陇;徐玉娟;吴继军;;生物柴油制备技术研究进展[J];广东农业科学;2012年01期
2 曾繁涤;李建新;石文英;何本桥;冯耀辉;;膜技术在生物柴油制备中的应用研究进展[J];功能材料信息;2010年02期
3 赵贵兴;陈霞;孙子重;;生物柴油的现状与发展前景[J];化工科技市场;2006年12期
4 付丽君;李冰璟;蒋文新;林志敬;应维琪;;低耗环保COD测定方法的研究[J];环境污染与防治;2008年03期
5 林水富;沈芸;;发展木本油料生物柴油产业的思考[J];林业经济问题;2010年02期
6 徐桂转;张百良;;生物柴油的研究与使用[J];农业工程技术(新能源产业);2007年05期
7 张恬,袁银南;生物柴油的环境效益与社会经济效益[J];能源环境保护;2005年02期
8 陈英明;陆继东;肖波;常杰;吕鹏梅;王铁军;;生物柴油原料资源利用与开发[J];能源工程;2007年01期
9 ;近十年全球生物柴油市场发展报告[J];科技与企业;2010年06期
10 姜楠,张正;生物柴油的现状与发展前景[J];世界农业;2005年03期
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 何亚辉;丙酮酸脱氢酶系测活方法的比较研究与创新[D];华中师范大学;2007年
2 王卫刚;固定化脂肪酶催化木本油脂制备生物柴油的研究[D];北京林业大学;2008年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈金思;胡献国;;固体酸、碱催化WCO制备生物柴油研究进展[J];安徽化工;2009年01期
2 查国君;张世敏;张无敌;尹芳;;茶籽油制备生物柴油的研究[J];安徽农学通报;2007年17期
3 张世敏;查国君;张无敌;尹芳;;一种绿色环保能源—生物柴油[J];安徽农学通报;2007年18期
4 方应明;杨保成;张飞;;生物柴油的发展研究现状[J];安徽农业科学;2007年26期
5 李霞;;生物柴油的发展及在江苏发展的潜力分析[J];安徽农业科学;2008年03期
6 郭晓萍;王建中;曲留柱;;响应面法优化超声波辅助提取绒藤脂溶性成分的工艺研究[J];安徽农业科学;2009年02期
7 程正载;雷锐;颜晓潮;林素素;聂玉静;胡雨黎;甘露;朱成奔;;菜籽油脚料制备生物柴油的研究[J];安徽农业科学;2011年05期
8 王琰;张志敏;王斌;陈斌;何玉婷;万一;马晓迅;;花椒籽油青睐型脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件的研究[J];安徽农业科学;2011年21期
9 胡敏;何昌义;;我国秸秆生物转化燃料酒精研究现状[J];氨基酸和生物资源;2006年03期
10 王风芹;王艳颖;谢慧;宋安东;;我国生物柴油原料来源的多样性探讨[J];氨基酸和生物资源;2008年01期
中国重要会议论文全文数据库 前8条
1 刘波;李理光;张旭升;周映;;生物柴油NOx排放机理及控制[A];2007年APC联合学术年会论文集[C];2007年
2 蒋文新;张光玉;詹水芬;应维琪;;Fenton组合工艺在焦化厂生化出水回用中的应用研究[A];中国环境科学学会2009年学术年会论文集(第一卷)[C];2009年
3 陈铭;陶德华;王成焘;;探讨我国生物柴油发展的现实与未来[A];环保和节能润滑技术论坛论文集[C];2005年
4 毕道村;;大力发展经济林木产业是实现我国生态现代化的重要途径[A];第五期中国现代化研究论坛论文集[C];2007年
5 黄文清;张俊飚;;加快生物柴油原料林基地建设的思考[A];发展低碳农业 应对气候变化——低碳农业研讨会论文集[C];2010年
6 陈冠益;孟祥梅;郑;陈慧;;碱催化废油脂制取生物柴油的实验研究[A];2005年中国生物质能技术与可持续发展研讨会论文集[C];2005年
7 孟祥梅;陈冠益;郑尊清;张春雷;;基于废油脂的生物柴油发动机性能试验[A];2005年中国生物质能技术与可持续发展研讨会论文集[C];2005年
8 孙思颖;;微生物发酵废水产油的研究进展[A];2007中国可持续发展论坛暨中国可持续发展学术年会论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李琴;酶法制备生物柴油新工艺及其高值化技术探索[D];华中科技大学;2010年
2 刘轩;中国木本油料能源树种资源开发潜力与产业发展研究[D];北京林业大学;2011年
3 郝一男;文冠果种仁油的提取及其生物柴油合成的研究[D];内蒙古农业大学;2011年
4 曹映玉;MCM-41基新型酸催化剂的合成、表征及催化性能研究[D];天津大学;2010年
5 李法社;小桐子生物柴油的超临界两步法制备及其抗氧化耐低温性的研究[D];昆明理工大学;2011年
6 王延耀;废食用油的燃料化机理及其燃烧性能的研究[D];中国农业大学;2004年
7 陈明;利用玉米秸秆制取燃料乙醇的关键技术研究[D];浙江大学;2007年
8 郑志;米根霉发酵产L-乳酸的代谢调控研究[D];合肥工业大学;2007年
9 钟耕;绿色工艺制备生物柴油探索[D];中国农业科学院;2007年
10 肖弥彰;高产脂肪酶菌种选育与脂肪酶催化合成生物柴油[D];湖南农业大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李珍宁;淡水藻的分离纯化与培养及藻体内生化成分的测定研究[D];华中农业大学;2010年
2 邢维贺;八种抗逆经济能源植物的生化成分与脂肪酸组成[D];辽宁师范大学;2010年
3 江怀真;培养条件对海水小球藻生长及油脂积累的影响[D];中国海洋大学;2010年
4 包建国;含氧模型化合物加氢脱氧催化剂的制备及其反应性能[D];湘潭大学;2010年
5 钟珍芳;制浆造纸废水深度处理的技术研究[D];华东理工大学;2011年
6 李法社;小桐子生物柴油制备的试验研究[D];昆明理工大学;2008年
7 李秀凤;固体超强酸SO_4~(2-)/ZrO_2-CeO_2的制备及在生物柴油中的应用[D];昆明理工大学;2010年
8 韩磊;碱性离子液体催化菜籽油制备生物柴油的试验研究[D];昆明理工大学;2010年
9 李明;离子液体催化脂肪酸酯化反应的研究[D];昆明理工大学;2010年
10 徐娟;高酸值植物油制备生物柴油的试验研究[D];昆明理工大学;2009年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郑明刚;随建强;郑立;韩笑天;崔志松;;基因工程在生物柴油原料中的应用研究[J];现代农业科技;2010年09期
2 侯继贤;鲁吉珂;聂开立;王芳;谭天伟;;固定化Candida sp.99-125脂肪酶催化大豆油合成脂肪酸乙酯[J];过程工程学报;2008年02期
3 王威浩;谭晓风;;植物脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶研究综述[J];经济林研究;2009年02期
4 柏杰;发展生物柴油大有可为[J];中国科技产业;2002年09期
5 张恬,袁银南;生物柴油的环境效益与社会经济效益[J];能源环境保护;2005年02期
6 周雍进;赵宗保;;先进生物燃料导向的脂肪酸途径合成生物学改造[J];生物工程学报;2011年09期
7 孟鑫;程涛;李良智;杨建明;刘炜;徐鑫;咸漠;;工程大肠杆菌脂肪酸胞外分泌调控研究进展[J];食品科学;2011年05期
8 何晨柳;孔任秋;胡晗华;;产蜡酯聚球藻PCC7002的构建[J];水生生物学报;2010年06期
9 李昌珠,蒋丽娟,李培旺,张良波,肖志红,李党训;野生木本植物油——光皮树油制取生物柴油的研究[J];生物加工过程;2005年01期
10 李金萍;张小兵;李茜茜;李忠;;中国生物柴油技术开发及应用进展[J];应用化工;2008年03期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 林琳;米糠油制备生物柴油及其乳化与燃料特性研究[D];江苏大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 史亚亚;樟树籽油制备轻质型生物柴油[D];南昌大学;2008年
2 杨实权;生物柴油基因工程菌的构建及酿酒酵母产油脂条件研究[D];北京化工大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 侯新村;牟洪香;杨士春;邢艳贞;靖静;;木本能源植物黄连木研究进展[J];安徽农业科学;2007年12期
2 曹宏远;曹维良;张敬畅;;固体酸Zr(SO_4)_2·4H_2O催化制备生物柴油[J];北京化工大学学报(自然科学版);2005年06期
3 吴虹,宗敏华,娄文勇;无溶剂系统中固定化脂肪酶催化废油脂转酯生产生物柴油[J];催化学报;2004年11期
4 陈志锋;吴虹;宗敏华;;固定化脂肪酶催化高酸废油脂酯交换生产生物柴油[J];催化学报;2006年02期
5 吴芹;陈和;韩明汉;王金福;王德峥;金涌;;高活性离子液体催化棉籽油酯交换制备生物柴油[J];催化学报;2006年04期
6 朱华平;吴宗斌;陈元雄;张萍;段世杰;刘晓华;毛宗强;;固体超强碱氧化钙催化制备生物柴油及其精制工艺[J];催化学报;2006年05期
7 贺芹;徐岩;滕云;王栋;;华根霉全细胞脂肪酶催化合成生物柴油[J];催化学报;2008年01期
8 李健,朱跃军,路光;华北地区的木本油料植物[J];中国林副特产;2001年01期
9 陈燕和;;燃料乙醇产业经济学分析与发展前景展望[J];产业与科技论坛;2007年07期
10 吴松;池淑梅;吴凯;;固载磷钨酸催化下用大豆油和甲醇制备生物柴油[J];大庆石油学院学报;2009年03期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 丁以钿;叶活动;刘五连;;废动植物油工业化生产生物柴油技术的研究[A];2005年中国生物质能技术与可持续发展研讨会论文集[C];2005年
2 徐瀚;缪晓玲;吴庆余;;利用淀粉水解液发酵生产工程小球藻制备生物柴油[A];2005年中国生物质能技术与可持续发展研讨会论文集[C];2005年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;西欧甘油产量猛增[J];国内外香化信息;1996年07期
2 ;生物柴油[J];技术与市场;1999年12期
3 黄显慈;降低生物柴油成本途径[J];粮食与油脂;2003年07期
4 ;合成生物柴油的方法[J];石化技术;2004年01期
5 盛梅,邬国英,徐鸽,巫淼鑫;生物柴油的制备[J];高校化学工程学报;2004年02期
6 聂开立,王芳,邓利,谭天伟;间歇及连续式固定化酶反应生产生物柴油[J];生物加工过程;2005年01期
7 巫淼鑫,邬国英,韩立峰,王俊德;食用植物油所制备生物柴油的低温流动性能[J];石油炼制与化工;2005年04期
8 柯为;;生物柴油研发进展[J];生物工程学报;2006年02期
9 郭春伟;;超速发展的生物柴油应用[J];中国洗涤用品工业;2006年02期
10 ;生物柴油的化学法生产[J];太阳能;2007年11期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 邓欣;方真;张帆;曾虹燕;廖凯波;邹大鹏;;纳米镁铝水滑石的制备及应用与生物柴油转化[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会(第二卷)[C];2010年
2 邓欣;方真;张帆;曾虹燕;廖凯波;邹大鹏;;纳米镁铝水滑石的制备及应用与生物柴油转化[A];第十二届中国科协年会——非粮生物质能源与高技术产业化研讨会论文集[C];2010年
3 景晓军;李孟良;;掺烧不同比例生物柴油的发动机性能研究[A];中国汽车工程学会燃料与润滑油分会第13届年会论文集[C];2008年
4 孙玉秋;陈波水;方建华;王九;;烯烃-醋酸乙烯酯混合共聚物对生物柴油低温流动性的影响[A];中国石化协会、润滑脂专业委员会一届二次全体成员大会暨全国第十五届润滑脂技术交流会论文集[C];2009年
5 胡志远;孙晓清;谭丕强;楼狄明;;共轨柴油机燃用麻疯树制生物柴油的性能及排放特性[A];全国农村清洁能源与低碳技术学术研讨会论文集[C];2011年
6 李率;蔺建民;张永光;;石化行业标准生物柴油氧化安定性测定方法的制定[A];中国汽车工程学会燃料与润滑油分会第13届年会论文集[C];2008年
7 张雅洁;刘双喜;景晓军;高俊华;;柴油机燃用不同比例棉籽生物柴油的试验研究[A];中国汽车工程学会燃料与润滑油分会第十四届年会论文集[C];2010年
8 余磊;马淑芬;;生物柴油对润滑油使用性能的影响及其评价方法[A];中国汽车工程学会燃料与润滑油分会第十四届年会论文集[C];2010年
9 吴江;陈波水;方建华;王九;;生物柴油的润滑性及机理研究[A];2011中国功能材料科技与产业高层论坛论文集(第一卷)[C];2011年
10 翟建华;邓一蕾;曹晓妹;;生物质柴油的生产方法及筛选[A];2009全国可再生能源—生物质能利用技术研讨会论文集[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 刘颖;泔脚废油能“变”能源[N];解放日报;2005年
2 记者 江山 实习生 李琳;泔脚“再生”可当汽车“饲料”[N];无锡日报;2005年
3 柳志卿;我贫困地区启动生物柴油项目[N];中国化工报;2006年
4 周洁;我省首个生物柴油厂年内有望投产[N];江苏经济报;2006年
5 支维墉;生物柴油发展难破原料“瓶颈”[N];江苏经济报;2007年
6 本报记者 董映璧;生物柴油:清洁的可再生能源[N];科技日报;2006年
7 赵侠;花椒籽油能转化为生物柴油[N];中国绿色时报;2007年
8 晓玲;华中农大已生产约3吨生物柴油[N];粮油市场报;2006年
9 ;浙江:大量民资涌入生物柴油制造行业[N];粮油市场报;2007年
10 记者 廖兴阳;生物柴油有望“解渴”云南油荒[N];昆明日报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李琴;酶法制备生物柴油新工艺及其高值化技术探索[D];华中科技大学;2010年
2 朱磊;生物柴油发动机燃烧控制与排放特性试验研究[D];上海交通大学;2012年
3 崔勇;非粮原料生物柴油及复合添加剂对非道路柴油机应用性能影响[D];江苏大学;2013年
4 吴毅峰;大豆生物柴油在不同环境条件下燃烧与碳烟排放特性的研究[D];华中科技大学;2010年
5 李法社;小桐子生物柴油的超临界两步法制备及其抗氧化耐低温性的研究[D];昆明理工大学;2011年
6 许广举;生物柴油非常规污染物形成机理的理论分析与试验研究[D];江苏大学;2012年
7 王显刚;生物柴油喷雾、燃烧和碳烟生成特性及其对柴油机微粒排放影响的研究[D];西安交通大学;2011年
8 李立琳;乙醇/生物柴油燃烧过程试验研究与理论分析[D];江苏大学;2013年
9 刘军锋;第三代生物柴油的开发研究[D];北京化工大学;2013年
10 郭峰;新型固体酸碱催化剂的制备及其在生物柴油合成中的应用[D];大连理工大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 薛刚;女贞籽油制备生物柴油的研究[D];西北农林科技大学;2010年
2 李娜林高娃;生物柴油合成新工艺研究[D];内蒙古大学;2010年
3 丁荣;固定化脂肪酶催化光皮树油脂合成生物柴油[D];中南大学;2010年
4 胡智杰;固体碱催化制备生物柴油的研究[D];长安大学;2010年
5 冯兵;光皮树籽生物柴油的酶促合成技术研究[D];湖南农业大学;2010年
6 王红娜;气升式反应器两步法生产生物柴油实验研究[D];郑州大学;2010年
7 李瑞贞;竹废料微波辅助裂解制备生物柴油抗氧化剂的研究[D];南昌大学;2010年
8 王友东;固定化重组脂肪酶催化木本植物油脂制备生物柴油研究[D];南京林业大学;2010年
9 申东美;糖基固体酸催化剂制备生物柴油的研究[D];哈尔滨工业大学;2010年
10 黄继伟;生物柴油静电雾化机理及喷雾特性的研究[D];江苏大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026