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SK3在早期胚胎发育、子宫内膜生长及子宫内膜癌发病中的作用研究

卢永超  
【摘要】:第一部分SK3在囊胚孵出中的作用及机制 目的:证实SK3在植入前胚胎的表达,探讨SK3在囊胚孵出中的作用及其机制。 材料和方法:首先收集临床上进行IVF/ICSI治疗并成功怀孕病人剩余需要销毁的胚胎进行体外培养,检测SK3表达水平与孵出之间的关系。然后用小鼠胚胎进行机制探讨。收集小鼠植入前胚胎,用RT-PCR、定量real-time PCR、western-blot和免疫荧光的方法检测SK3在胚胎上的表达。用SK3特异的siRNA采用显微注射的方法进行体外敲除,应用实时图像分析结合膜片钳技术观察滋养细胞内钙、膜电位的变化;以及体外培养观察卵裂和囊胚孵出情况。并应用免疫荧光的方法了解F-actin的组装。 结果:人类胚胎孵出失败的囊胚SK3表达水平较低。小鼠胚胎受精后从2细胞阶段开始表达并逐渐增加,至囊胚阶段明显增加,并开始定位于胞膜上。SK3体外敲除的胚胎滋养细胞在毒胡萝卜素(TG)刺激下细胞内钙上升幅度明显减小,膜电位超级化幅度也明显减少。SK3敲除不影响卵裂和囊胚形成却明显影响囊胚的孵出,而且SK3敲除也使滋养细胞F-actin的组装也明显减少。 结论:SK3在植入前胚胎有表达并在囊胚阶段开始有功能。SK3可能通过影响囊胚滋养细胞内钙水平而影响F-actin的组装,从而影响滋养细胞在孵出时的运动而影响囊胚孵出。 目的:证实SK3在人子宫内膜上皮细胞表达,了解SK3表达水平与内膜厚度和形态之间的关系,并进一步探讨SK3在子宫内膜上皮细胞功能中的作用机制。 材料和方法:采用定量real-time PCR方法检测SK3在人类子宫内膜的表达及表达水平与子宫内膜厚度和形态的相关性。应用蛋白半定量的方法探讨子宫内膜SK3蛋白表达水平与IVF治疗过程中妊娠结局的关系。应用RT-PCR、western-blot和免疫荧光的方法检测SK3在正常内膜的表达。应用SK3特异的siRNA转染的方法建立人子宫内膜上皮细胞体外敲除模型。应用实时图像分析结合膜片钳技术检测SK3体外敲除后细胞内钙和膜电位的变化。体外培养情况下检测雌孕激素对子宫内膜上皮细胞SK3表达的影响。观察体外敲除后细胞迁移能力的变化以及F-actin的组装情况。体外培养结合实时图像分析以及免疫共沉淀技术,探讨SK3是否参与了cAMP激活的钙离子介导的张力蛋白组装。 结果:研究证实SK3在内膜上皮细胞有表达,而且表现为在增殖期高表达而在分泌期低表达。内膜活检也证实SK3表达水平与内膜厚度相关,即内膜厚度越薄SK3表达水平越低,而且相同厚度情况下,SK3表达水平无明显三线征内膜较三线征明显的内膜低。IVF治疗中妊娠失败的病人内膜SK3蛋白表达水平较成功妊娠病人低。体外敲除实验证实,在SK3体外敲除细胞毒胡萝卜素诱导的细胞内钙升高幅度降低,与此同时膜电位超极化幅度也降低。研究还表明,雌激素可以呈浓度依赖性上调SK3的表达,而孕激素则可以抑制雌激素的上调作用。此外,SK3体外敲除可以明显抑制细胞的迁移能力,并可以抑制F-actin的组装。在SK3体外敲除细胞,8-pMeOPT诱导的细胞内钙上调明显降低,而且8-pMeOPT诱导的细胞迁移也明显降低,S100A4与MHCⅡA的结合也明显减少。 结论:SK3在子宫内膜上皮细胞表达,并通过影响cAMP激活的钙通路参与了细胞迁移过程。SK3的低表达可以抑制子宫内膜生长过程中的上皮细胞迁移,这可能是不能形成正常内膜结构的原因。也可能是临床上内膜较薄和形态异常导致低妊娠率的原因之一。 目的:证实SK3在子宫内膜癌中表达,了解SK3的表达水平及其与内膜癌细胞功能之间的关系。进一步探讨SK3在雌激素诱导的子宫内膜腺癌细胞侵袭浸润过程中的作用和机制。 材料和方法:RT-PCR的方法证实SK3在子宫内膜腺癌组织肌细胞系表达。定量real-time PCR和western-blot的方法检测癌组织的表达水平,及不同分化程度细胞系表达水平。采用western-blot的方法了解体外培养条件下雌激素对IK细胞SK3表达的调节。应用SK3特异的siRNA转染的方法建立IK细胞体外敲除模型。采用划痕试验、侵袭实验探讨SK3体外敲除后细胞迁移侵袭能力的变化。采用免疫荧光技术和Dio染色技术观察SK3体外敲除后F-actin的组装情况和细胞形态的变化。分别应用雌激素核受体抑制剂ICI182780和膜受体抑制剂G15处理细胞,用western-blot的方法检测SK3的表达情况,了解雌激素对SK3表达调节方式。实时图像分析技术探讨SK3在雌激素膜受体诱导的细胞迁移过程中作用机制。用western-blot的方法对钙通路下游与细胞运动有关的激酶活性进行检测。 结果:SK3在子宫内膜癌组织高表达,不同的细胞系中,随着细胞的分化程度降低SK3表达水平增高。雌激素可以呈浓度依赖性地上调SK3的表达。SK3体外敲除可以抑制雌激素诱导的细胞迁移和侵袭,并可以抑制雌激素诱导的F-actin的重组并使细胞突起退缩。雌激素主要通过核受体上调SK3的表达,SK3参与了雌激素膜受体诱导的与细胞运动有关的钙通路的激活,从而促进了细胞的迁移和侵袭。 结论:SK3在子宫内膜腺癌组织高表达,分化程度越低表达水平越高。雌激素可以上调SK3的表达,SK3参与了雌激素膜受体诱导的钙通路的激活,从而促进了子宫内膜腺癌细胞的迁移和侵袭。


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