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《浙江大学》 2011年
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PLGA/羟基磷灰石复合支架的制备及其用于骨修复的研究

李丹  
【摘要】:组织工程和再生医学的发展为临床上骨缺损的修复和治疗提供了希望。作为骨组织工程技术关键的要素之一,骨组织工程支架制备受到了广泛关注。将羟基磷灰石粒子与聚合物复合制备骨组织工程支架,能够结合聚合物与羟基磷灰石粒子的优点。但在以往的聚合物/羟基磷灰石粒子复合支架的制备中,一般都将羟基磷灰石粒子与聚合物溶液或者熔体预先混合,这就导致大部分生物活性羟基磷灰石粒子都被包埋在聚合物基体内部,在体外培养或者植入缺损部位早期无法与种子细胞有效接触。因此,制备大孔表面具有羟基磷灰石粒子涂层的复合支架具有重要意义。 本文采用"pickering"乳液法制备了羟基磷灰石涂覆的石蜡微球,并以此微球为致孔剂,通过热粘结、PLGA溶液浸泡、冻干和石蜡去除等过程,将羟基磷灰石粒子成功地从微球表面转移到PLGA/HA-S支架的大孔壁上,制得大孔表面具有纳米羟基磷灰石涂层的PLGA/HA复合支架(PLGA/HA-S).作为对照,以纯石蜡微球为致孔剂制备了羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在PLGA基体中的复合支架PLGA/HA-M (HA含量为2%)以及PLGA支架。支架孔径均在450~600μm,孔隙率90~93%,PLGA/HA-S支架显示了最高的压缩模量。 在模拟体液浸泡时,PLGA/HA-S支架表面纳米羟基磷灰石涂层促进了支架表面磷灰石的沉积,支架压缩模量随浸泡时间延长显著增加。体外前成骨细胞培养表明三种支架都具有较好的生物相容性。体外大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)培养表明,三种支架上的细胞形态铺展,细胞数量随时间延长而增加,但无明显差别,诱导分化培养14天后,PLGA/HA-S支架上细胞碱性磷酸酶活性显著高于PLGA支架。 将骨髓间充质干细胞负载于支架中,植入大鼠颅骨缺损(直径5mm)。4周后取样,采用Mico-CT检测新骨形成,切片后行苏木素-伊红染色(H-E)。结果表明,负载骨髓间充质干细胞后,三组支架均有新骨形成,PLGA/HA-S支架能够更好地促进新骨形成。小动物成像和冰冻切片结果表明植入的大鼠骨髓间充质干细胞在4周后依然存活。 为了研究支架对重组人源骨形态发生蛋白-2(ErhBMP-2)诱导的骨形成的影响,将大鼠骨髓间充质干细胞种植在PLGA/HA-S, PLGA/HA-M和PLGA支架上,研究大鼠骨髓间充质干细胞在含有ErhBMP-2培养基中的成骨分化。实验结果表明培养14天后,PLGA/HA-S支架上细胞碱性磷酸酶活性以及Ⅰ型胶原(COL I)和骨钙素(OCN)基因的表达最高。将ErhBMP-2负载到支架上植入到大鼠颅骨缺损,发现植入4周和8周后PLGA/HA-S支架有更明显的新骨形成。 生长因子容易失活并且价格昂贵,采用季铵化壳聚糖(TMC)作为质粒DNA(pDNA-BMP-2)的载体,通过TMC和pDNA之间的静电作用,将pDNA压缩形成纳米复合粒子,并同时将骨髓间充质干细胞和基因复合粒子与PLGA/HA-S支架复合。体外培养中TMC/pDNA对BMSCs的转染效率为13%。TMC/pDNA-BMP-2转染骨髓间充质干细胞后在10天内持续表达BMP-2。将构建的PLGA/HA-S/(TMC/pDNA-BMP-2)/骨髓间充质干细胞片植入大鼠颅骨缺损处,以无pDNA-BMP-2或骨髓间充质干细胞片为对照。植入两周后取样,qRT-PCR检测到实验组异种的BMP-2的表达。采用Micro-CT和组织学染色研究新骨形成,发现植入4周,实验组即有明显新骨形成,8周后,实验组骨缺损部分桥接,新骨形成的量显著高于无pDNA或骨髓间充质干细胞片组。不含pDNA组,缺损中心和边缘均有新骨形成,而未加入骨髓间充质干细胞片组,则主要生成了纤维组织,仅在缺损边缘有少量新骨形成。负载功能pDNA-BMP-2能够上调BMP-2表达,促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化及骨细胞外基质的合成,促进骨缺损的修复。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R318.08

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