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《浙江大学》 2013年
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法尼基焦磷酸合成酶在心血管重塑中的作用研究

杨剑  
【摘要】:研究背景: 心肌肥厚和充血性心力衰竭是全世界人类死亡的主要原因之一。心肌肥厚是心力衰竭早期心肌细胞对室壁应力增加的一种重要的适应性、代偿性反应,最终会导致充血性心力衰竭。 法尼基焦磷酸合成酶(famesyl pyrophosphate synthase, FPPS)是甲羟戊酸途径中的一种关键酶,它催化合成异戊二烯化产物,包括法尼基焦磷酸(FPP)和牻牛儿牻牛儿焦磷酸(GGPP)。最新的研究表明FPPS在血管紧张素Ⅱ (Ang Ⅱ)诱导的心肌肥厚细胞中以及自发性高血压大鼠中表达明显增高,同时在自发性高血压大鼠中抑制FPPS可以减轻心肌肥厚和改善血管重塑。这些结果都与RhoA相关,而GGPP对RhoA的牻牛儿牻牛儿焦磷酸化和活化非常重要。 目的: 本研究利用转基因动物模型来进一步探讨FPPS与心肌肥厚和心力衰竭的关系,并研究其机制。 方法: (1)构建心脏特异性过表达FPPS转基因模型。 (2)使用real-time PCR、western-blot、免疫组化等技术检测转基因小鼠心脏组织中FPPS表达水平。 (3)使用高效液相色谱法(HPLC)技术检测转基因小鼠心脏组织中FPP和GGPP水平,酶法测定组织胆固醇浓度。 (4)使用超声心动图、病理染色、心导管等方法检测转基因小鼠心脏功能及形态学变化。 (5)使用real-time PCR技术检测小鼠心脏心肌肥厚基因(ANP、BNP、β-MHC)以及心肌纤维化基因(TGF-β、CTGF)表达。 (6)使用G-Lisa方法检测小鼠心脏RhoA、Rac1、Cdc42、Ras等小G蛋白表达水平,使用western-blot方法检测小鼠心脏Erk1/2、P38MAPK、 Akt/GSK3β等的活性。 (7)表达FPPS的腺病毒感染心肌细胞,免疫荧光鉴定心肌细胞表面积。FPPS抑制剂阿伦磷酸钠或者Rho的抑制剂C3exoenzyme、Ras抑制剂farnesylthiosalicylic acid (FTS)在感染后加入心肌细胞。 (8)在腺病毒感染的心肌细胞中检测RhoA、Ras、Erk1/2、P38MAPK、 Akt/GSK3β等活性。 (9)使用HPLC技术检测心肌细胞中FPP和GGPP水平,酶法测定细胞胆固醇浓度。 结果: (1)转基因小鼠心脏组织中FPPS表达明显增加。 (2)心脏特异性表达FPPS增加了FPP和GGPP、胆固醇合成。 (3)心脏特异性表达FPPS诱导心肌肥厚基因(ANP、BNP、β-MHC)、心肌纤维化基因(TGF-β、CTGF)表达增高,最终导致心肌肥厚、纤维化、心力衰竭。 (4)心肌细胞腺病毒过表达FPPS诱导心肌细胞肥厚基因表达、细胞体积增大。心肌细胞中加入阿伦磷酸钠或者C3exoenzyme可抑制FPPS过表达导致的心肌细胞肥大。 (5)心脏特异性表达FPPS诱导RhoA活性增高,磷酸化的ERK和p38表达上调,与体内结果一致,心肌细胞腺病毒过表达FPPS导致RhoA活性增高,磷酸化的ERK和p38表达上调。 结论: FPPS及FPPS调控的信号转导通路在心肌重塑过程中具有重要的作用。 研究背景: 血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)是一种血管加压素,肾素-血管紧张素系统(RAS)的八肽激素中间体。相当多的证据表明,AngⅡ在心肌肥厚和纤维化起着重要的作用。在以往的研究中,我们发现FPPS的表达水平在AngⅡ刺激的肥厚心肌细胞中显著增加,这表明FPPS在AngⅡ引起的心肌肥厚中发挥着重要的作用。另外也研究发现在心肌细胞中通过小分子RNA干扰抑制FPPS基因表达或者药物阿伦磷酸钠抑制FPPS可以阻止AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。 目的: 本研究观察抑制FPPS对体内AngⅡ介导的心肌肥厚和纤维化的影响,并探讨其机制。 方法: (1)野生型小鼠分为四组:生理盐水,血管紧张素Ⅱ(2.88毫克/公斤/天),阿伦磷酸钠(0.1毫克/公斤/天),或血管紧张素Ⅱ(2.88毫克/公斤/天)和阿伦磷酸钠(0.1毫克/公斤/天)持续微泵注射4周。 (2)使用real-time PCR、western-blot等技术检测各组小鼠心脏组织中FPPS表达水平。 (3)使用HPLC技术检测各组小鼠心脏组织中FPP和GGPP水平。 (4)使用超声心动图、病理染色等方法检测各组小鼠心脏功能及形态学变化。 (5)使用real-time PCR技术检测各组小鼠心肌肥厚基因(ANP、BNP)以及心肌纤维化基因(TGF-β1、Procollagen Ⅰ、Procollagen Ⅲ)表达。 (6)使用G-Lisa方法检测RhoA蛋白表达水平, western-blot方法检测P38MAPK的活性。 结果: (1) AngⅡ诱导小鼠心肌肥厚和纤维化。 (2)抑制FPPS改善AngⅡ诱导的小鼠心肌肥厚和纤维化。 (3) AngⅡ增加FPPS的表达,抑制FPPS减少AngⅡ小鼠中磷酸化P-38的表达。 (4)抑制FPPS降低AngⅡ诱导的ANP, BNP, TGF-β1, Procollagen Ⅰ, Procollagen ⅢmRNA及ANP, TGF-β1, collagen Ⅰ, collagen Ⅲ蛋白表达增加。 (5)抑制FPPS降低AngⅡ诱导的FPP和GGPP水平增加 (6)抑制FPPS减少AngⅡ诱导的RhoA活性增加。 结论: FPPS在AngⅡ诱导的心肌肥厚和纤维化过程中具有重要的作用,至少部分是通过抑制RhoA的活化,减少p38的磷酸化和下调TGF-β1的表达来实现的。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R541

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【参考文献】
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