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《浙江大学》 2012年
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微生物高效生产γ-聚谷氨酸和β-聚苹果酸的研究

张慧莉  
【摘要】:γ-聚谷氨酸(Poly-γ-glutamatic acid, β-PGA)和β-聚苹果酸[poly(β-L-malic acid),PMLA]是两种受到人们关注的生物可降解水溶性聚合物材料,由于其优良的特性在医药和其他广泛领域有极大应用潜力。本文对于两种生物聚合物的微生物合成进行了系统研究。 首先,开展了对微生物合成γ-PGA的研究。以直接利用葡萄糖合成γ-PGA为目的,筛选获得一株谷氨酸非依赖型γ-PGA生产菌株,经过VITEK系统鉴定和16srDNA序列分析鉴定,命名为Bacillus subtilis ClO。对C10的发酵生产γ-PGA的培养条件进行了优化,发现柠檬酸能够作为C10菌株合成γ-PGA前体;在此基础上,以柠檬酸为底物在发酵罐上进行了间歇发酵和流加发酵培养,通过在发酵中后期流加柠檬酸和氯化铵溶液,γ-PGA产量达到38.2g/L。为了寻找有效提高γ-PGA产量的因素,研究了多种有机酸对于γ-PGA合成的影响,发现草酸能够在低浓度范围内显著促进菌体生长和γ-PGA合成。对关键节点酶活性的影响与代谢途径进行分析,结果表明草酸不进入γ-PGA的合成途径,而柠檬酸可以直接通过TCA循环进入γ-PGA的合成途径,间接作为谷氨酸合成的底物;草酸使丙酮酸脱氢酶活性增加是影响从葡萄糖从头合成谷氨酸的重要因素。对添加柠檬酸和草酸条件下的B. subtilis C10合成γ-PGA的代谢流进行分析,柠檬酸条件下,进入EMP途径的流量减弱,代谢流向HMP途径迁移;而在α-酮戊二酸节点碳流大部分流向γ-PGA合成途径;草酸条件下,α-酮戊二酸节点碳流大部分流向TCA循环,要提高γ-PGA的产量,必须弱化α-酮戊二酸脱氢酶的活性。 其次,开展了出芽短梗霉合成β-聚苹果酸的研究。分离了一株高产PMLA的生产菌株,对筛选到的菌株进行ITS序列分析鉴定,确定属于A ureobasidium Pullulans,命名为ZD-3d.对产物进行FT-IR和13C-NMR鉴定,确定为PMLA; PMLA酸水解产物为苹果酸、马来酸和富马酸;对PMLA的酸水解过程进行了研究,建立了PMLA水解释放苹果酸的动力学模型。接着对发酵培养条件进行了优化,发现富马酸能够促进菌体合成PMLA,5g/L富马酸能够使PMLA产量达到62.27g/L;碳酸钙能够调节菌体合成胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)和PMLA的碳流方向,添加碳酸钙强烈刺激菌体合成PMLA,而抑制普鲁兰多糖的产生。对出芽短梗霉ZD-3d在1OL发酵罐上进行放大培养,PMLA最终浓度57.2g/L. PMLA的最大产率为0.35g/L/h,转化率为0.47g/g葡萄糖。 本论文对于γ-聚谷氨酸和β-聚苹果酸在相应菌株中的生物合成与代谢机理提出了一些新的研究视角,也为未来工业化生产这两种重要的生物聚合物提供一些新的策略。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:TQ920.6

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【参考文献】
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