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二硫键异构酶类蛋白在植物响应汞胁迫中的作用

陈珍  
【摘要】:汞(mercury, Hg),是人类食物链中毒性最强的重金属之一。汞矿的开采、含汞废弃物的排放、化肥和农药的不合理施用等,已造成环境汞污染日益严重,对动植物的生长发育和人类的健康造成了严重威胁。Hg易被植物吸收,其与巯基(-SH)有很强的亲和力,能与亲水蛋白中的半胱氨酸(Cys)残基结合,扰乱任何未受保护蛋白质的功能;抑或是作为二价阳离子,取代金属酶的辅基如Mg2+、Mn2+、Zn2+等,导致酶活性下降或丧失;此外汞诱导的活性氧自由基会引起巯基氧化和二硫键交联等损伤,从而抑制植物的生长发育。因此,如何保护巯基与二硫键,防止蛋白的变性与聚集,保证正常的代谢,亟待研究。 蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI; EC5.3.4.1)及其类蛋白(PDIL),是硫氧还蛋白超家族的一员,具有催化蛋白质二硫键氧化、还原及异构的功能;且具有分子伴侣活性,可促进蛋白质的折叠与装配,并可防止变性蛋白的聚集。但迄今为止PDI在植物响应汞胁迫中的作用还未见报道。本文首次研究了汞胁迫下水稻PDILs(OsPDILs)的表达变化,并证实过表达来自嗜热自养甲烷杆菌的PDIL (MTH1745)可提高植物对汞等胁迫的耐性,实现了深海基因资源的利用。具体结果如下: 1)利用生物信息学方法分析了水稻自身二硫键异构酶类蛋白(OsPDILs)的基本信息、结构域、分类、定位及表达,结果表明12个OsPDILs氨基酸长度从148aa到563aa不等,具有1至2个Trx (CXXC)结构域,分布在9条染色体上,基因表达分析(UniGene数据库和MPSS数据)表明这12个OsPDI基因表达具有组织差异性与生长发育阶段差异性。 2)以水稻‘日本晴’(Oryza sativa L., cv.Nipponbare)为材料,采用荧光定量PCR分析了12个OsPDILs基因在汞胁迫下的表达变化,结果表明,75μM HgCl2胁迫可诱导水稻幼苗根中OsPDIL1-1、OsPDIL1-3、OsPDIL5-1、OsPDIL5-2及OsPDIL5-3表达显著上调,OsPDIL1-2表达下调,而OsPDILs2-1、OsPDILs2-3釉OsPDILs5-4等无显著变化。 3)将来源于嗜热自养甲烷杆菌杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicum)的PDIL蛋白编码基因(MTH1745),通过农杆菌介导的花序转化法导入拟南芥,获得含目的基因的纯合株系,逆境处理实验结果表明转基因拟南芥能提高对汞胁迫的耐性,且对高温和盐胁迫也具有较强的耐性。 4)将MTH1745通过农杆菌介导导入水稻‘日本晴’中,获得了MTH1745组成型高表达(CaMV35S启动子)的纯合株系。结果表明,在不同浓度HgCl2处理下转基因水稻生长优于野生型,具有更强的抗性。转基因植株的光合效率(净光合速率Pn、气孔导度Gs、蒸腾速率Tr)、抗氧化酶(SOD、POD等)活性、非蛋白硫醇(NPT)和还原态谷胱甘肽(GSH)含量均明显高于野生型,这意味着转基因植株有可能通过维持蛋白质的合成,提高含巯基(-SH)类物质和二硫键化合物活性,保护光合作用过程中关键酶等,防止膜脂过氧化损伤,从而起到缓解汞引起的毒害作用。


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