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Paenibacillus elgii B69胞外多糖结构鉴定及生物合成途径研究

李欧  
【摘要】:多糖是由多个相同或者不同的单糖(通常为10个以上)通过糖苷键连接聚合而成的长链高分子聚合物。研究表明,多糖广泛参与细胞各种生命现象的代谢活动,与核酸、蛋白质以及脂类一起构成生命活动的四大基本物质。多糖种类多样,根据其不同的来源可以分为动物多糖、植物多糖、微生物多糖(细菌和真菌多糖)以及藻类多糖。细菌胞外多糖一般是细菌细胞在高碳氮比的培养基中,在生长代谢过程中合成并分泌到胞外的多糖或多糖混合物。最近几十年,由于石油危机,基于石化资源获得的高分子聚合物的价格越来越高,其应用逐渐受到限制。细菌具有生长周期短、不受气候和地理环境等因素影响的特点,可在人工控制条件下以工业废料或其他可再生能源为底物进行工业化生产从而获得大量胞外多糖的产品。通过此方法获得的胞外多糖,安全无毒,具有良好的组织相容性、独特的理化性质以及生物可降解等优点,常可用作增稠剂、稳定剂、悬浮剂、胶凝剂、乳化剂、和润滑剂等,在食品、医药、化工、农业及生物工程等领域得到了广泛应用。 类芽孢杆菌属细菌是新型细菌胞外多糖的重要来源之一,但前人的研究一般侧重于多糖的结构鉴定及应用,很少涉及生物合成途径的研究。为了获得具有潜在应用价值的新型胞外多糖并为其他胞外多糖的生物合成途径研究提供借鉴,以及为后续在基因水平上通过组合生物学对现有多糖结构定向改造提供理论依据,开展了本研究。 我们前期研究中发现,实验室新分离得到的一株类芽孢杆菌属菌株Paenibacillus elgii B69能产生大量的胞外多糖。进一步的研究表明,此菌所产多糖对多种污水中的污染物具有较高的絮凝活性。此多糖经分离纯化后进行单糖组成分析,结果表明含有木糖;细菌胞外多糖中含有木糖是极为罕见的。为了研究此胞外多糖中木糖的合成过程,我们鉴定了多糖的结构并研究了其完整的生物合成途径。主要研究过程及结果如下: 1、蛋白酶及Sevag试剂联用对P. elgii B69胞外多糖进行初步去蛋白。所得样品经离子交换柱Q sepharose fast flow及尺寸排阻柱Sepharose CL-6B纯化,获一多糖主峰。单糖组成分析表明此胞外多糖含有葡萄糖、木糖、葡萄糖醛酸及甘露糖,其摩尔比为1.95:2.07:1:0.93。进一步用高碘酸氧化Smith降解、部分酸水解、甲基化GC-MS测定、多糖降解酶酶解后的寡糖进行碰撞诱导解离串联质谱测定(CID-MS/MS)等方法分析多糖的结构。最终确定该多糖为一种新的胞外多糖,可能结构见下图(不同单糖用不同的颜色表示): 2、多糖中木糖的加成需要核苷糖前体UDP-木糖,为了研究UDP-木糖的合成机理,经全基因组分析找出了与UDP-木糖合成相关的酶——UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶(又称UDP-木糖合酶)编码基因Peuxsl和Peuxs2,并进行异源表达,体外反应显示了UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶的活性;进一步通过实时核磁共振分析确定了其反应机理。为了明确酶的胞内活性,构建了以胸腺嘧啶为筛选标记的新的敲除载体,以新筛选到的胸腺嘧啶营养缺陷型菌株为出发菌株,成功敲除了相关的基因,并分析了胞内相关酶的酶活及其对胞外多糖产量及组成的影响。结果表明Peuxsl或Peuxs2单基因敲除菌株中胞内UDP-木糖和UDP-葡萄糖醛酸的含量受到影响,胞外多糖的产量降低且各单糖比例也发生了相应的改变,双基因敲除菌株则失去了合成胞外多糖的能力,从而确定了上述两个UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶的功能。 3、对多糖生物合成基因簇的序列分析表明存在6个可能的糖基转移酶基因,正好催化多糖重复单元中6个不同的糖苷键。在本研究中我们尝试逐个敲除6个糖基转移酶从而研究每个酶具体的催化功能。但是,只有两个糖基转移酶被成功敲除,这两个酶在后续的研究中被证实分别为葡萄糖糖基转移酶及木糖糖基转移酶,其作用分别为催化重复多糖的第一个单糖葡萄糖的组装和最后一个单糖支链木糖的组装。另外4个糖基转移酶却不能够被敲除,有可能是因为敲除后代谢中间产物的堆积而产生的致死作用。因此,为了研究这些糖基转移酶的作用,我们通过异源表达并纯化相应的酶测定其胞外糖基转移酶活性。用EDTA处理细胞后,提取细胞膜并以膜上含有的脂载体作为催化的受体,分别添加相关的核苷糖前体,经质谱分别分析反应产物并确定了各个糖基转移酶相应的催化底物及受体,从而初步探明了与多糖重复单元合成有关的6个糖基转移酶的功能。 4、在大量针对类芽孢杆菌的研究中发现了许多新的胞外多糖,但是,却没有对这些多糖生物合成途径进行深入探索。多糖的生物合成途径较复杂,主要可分为以下三步:核苷糖前体的合成、寡糖重复单元的组装及多糖的聚合与输出。本文分析了P. elgii B69胞外多糖生物合成基因簇,发现其由20.2kb的序列组成,包括18个可能的开放阅读框,其转录方向都是一致的。除上述已研究的6个糖基转移酶外,多糖生物合成基因簇中还包括4个编码与糖核苷糖前体UDP-葡萄糖、UDP-木糖、UDP-葡萄糖醛酸和GDP-甘露糖合成直接相关的酶的基因。与NDP-糖的间接前体合成有关的基因则不在多糖生物合成基因簇中,而是遍布于染色体的其他位置。另外还有6个基因与多糖的聚合与输出有关。上述16个基因与多糖的合成紧密相关,由同一个启动子控制并共转录,还有两个可能编码多糖降解酶的基因则由另外一个启动子操纵。本文首次分析了类芽孢杆菌中P. elgiiB69胞外多糖的生物合成途径及其合成过程,为本属中其他菌株的多糖生物合成途径的解析提供了重要借鉴。


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