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《浙江大学》 2015年
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过氧化氢与一氧化氮互作调控小麦耐铝性的生理与分子机制

孙成亮  
【摘要】:全球大约30%的土地面积和50%的潜在可耕地面积属于pH低于5.5的酸性土壤。我国的酸性土壤主要分布在南方15个省区,约占耕地面积的21%。铝毒是酸性土壤上限制作物生长最重要的障碍因子。铝毒最典型的早期症状是根系伸长受抑制,影响植物对水分和养分的吸收,进而限制作物产量的提高,严重威胁全球的粮食安全。关于植物铝毒和耐铝性机理方面已作了大量研究,但对植物适应铝毒胁迫的信号调控机制尚不完全清楚。过氧化氢(H2O2)和一氧化氮(NO)是植物在逆境胁迫应答中起重要调节作用的关键信号分子,处于胁迫信号网络的中心环节,常同时出现且共同参与调控过程,并表现出相互协同性或依赖性。关于H2O2或NO单独对植物铝毒的缓解作用已有一些研究报道,但是关于H2O2和NO信号互作对植物耐铝性的调控作用及其分子生理机制尚少见研究报道。本论文以耐铝性差异明显的2个小麦基因型为材料,采用植物生理生化和分子生物学等技术相结合的方法,围绕铝诱导的NO早期猝发及其与耐铝性的关系、铝诱导产生的NO对小麦根尖AsA-GSH循环的影响及其与耐铝性的关系、铝诱导产生的NO对小麦根细胞壁特性的影响及其与根系伸长的关系、H2O2与NO互作在小麦适应铝胁迫中的作用及其机理、H2O2、NO和MAPK在铝胁迫诱导小麦根尖抗氧化系统中作用及其相互关系等方面进行了研究。取得的主要结果如下:1.采用组织染色和化学测定的方法,研究了铝胁迫下小麦根尖活性氧(ROS)、活性氮(RNS)以及抗氧化系统的变化。结果表明,根系伸长和活力均随着铝浓度的提高而降低,但鉴-864显著高于扬麦5号。30μM铝处理24 h后,鉴-864根尖O2、H2O2、NO、ONOO-的染色程度较轻;而敏感基因型扬麦5号根尖中O2、H2O2、NO、ONOO-的染色深度和荧光强度显著增加。细胞膜完整性(Evans blue染色)和膜脂过氧化(SchifF's reagent染色)结果表明,铝胁迫下扬麦5号根尖氧化损伤的程度显著高于鉴-864;而前者的抗氧化酶(CAT)活性和抗氧化物质(AsA、GSH)含量显著低于后者。因此,清除根尖过量积累的ROS和RNS,维持体内氧化还原稳态是其对铝毒胁迫耐性较强的重要原因。2.采用组织荧光染色法,研究了铝胁迫下小麦根尖不同时间NO含量的变化、来源及其与耐铝性的关系。结果表明,30州铝处理3h可诱导耐性基因型鉴-864根尖出现NO的早期猝发;而敏感基因型扬麦-5号无此NO信号,但12h后其NO含量显著增加。添加NO供体(SNP)可诱导敏感基因型扬麦5号根尖NO的早期猝发,降低胼胝质和ROS的含量,减轻铝对小麦根尖的氧化损伤,进而缓解铝对根系伸长的抑制。清除鉴-864根尖早期猝发的NO(添加NO专一清除剂,cPTIO)则加剧了铝对根系伸长的抑制效果。铝处理3h可显著提高鉴-864根尖硝酸还原酶(NR)活性,而对一氧化氮合酶(NOS)无明显影响。铝处理12h后扬麦-5号根尖NOS酶活性增加了3.5倍,而NR活性显著降低。NR抑制剂可完全抑制鉴-864根尖NO的早期猝发,而NOS抑制剂无此作用效果,但可明显降低扬麦5号根尖12h后NO的荧光强度。铝胁迫诱导鉴-864和扬麦5号根尖抗氧化酶活性的提高,但鉴-864显著高于扬麦-5号。NO供体可进一步提高铝胁迫下根尖抗氧化酶活性,而NO清除剂或NR抑制剂则显著降低了鉴-864根尖抗氧化酶活性。可见,铝诱导依赖于NR的NO早期猝发,可提高抗氧化酶活性,降低ROS的积累,减轻铝对根系造成的氧化损伤,从而增强小麦对铝毒的耐性。3.通过组织染色、化学测定结合根尖RNA提取及PCR技术,研究了铝胁迫下NO对AsA-GSH循环系统的调控作用。结果表明,铝胁迫抑制根系伸长,引起质膜过氧化损伤,促使还原型AsA和GSH转变为氧化型DHA和GSSG,且扬麦5号变化幅度较大。通过NO供体(SNP)诱导早期猝发的NO可显著缓解铝对小麦根系伸长的抑制,增加根尖还原型AsA和GSH的含量,提高AsA/DHA和GSH/GSSG的比值。铝胁迫显著提高了鉴-864根尖APX、GR和DHAR等酶的活性和基因表达水平,而对扬麦5号无显著影响。NO供体(SNP)处理显著提高了扬麦5号根尖上述酶的活性和基因表达水平。铝和NO处理对GSH合成酶γ-ECS的活性与表达无显著影响,但NO供体(SNP)显著增加了GSH代谢相关酶GPX和GST的活性。此外,铝胁迫显著降低了脯氨酸含量,而NO供体对其无显著影响。可见,NO通过提高AsA-GSH循环中主要酶活性,增强AsA-GSH循环的高效运行,促进AsA和GSH的循环再生,维持体内较高的AsA和GSH含量,清除过量积累的ROS,降低氧化损伤,从而缓解铝对根尖的氧化胁迫。4.选用铝胁迫下NO响应强烈的敏感基因型扬麦5号为材料,通过分级提取细胞壁组分、单克隆抗体结合免疫组织荧光、组织化学测定等方法,研究了铝诱导产生的NO对小麦根尖细胞壁组分和性质及铝毒效应的影响。结果显示,NO清除剂(cPTIO)可以显著缓解铝对扬麦5号根系伸长的抑制,降低根尖铝的积累。NO清除剂对铝胁迫下小麦根系苹果酸分泌及根际pH无明显影响。铝胁迫下扬麦5号根尖细胞壁果胶、半纤维素1和2的含量以及果胶甲酯酶活性显著提高,但果胶甲酯化程度显著降低。NO清除剂对铝胁迫下根尖细胞壁果胶、半纤维素1和2含量无影响,但显著降低了果胶甲酯酶活性,提高了果胶甲酯化程度。免疫组织荧光显示,NO清除剂提高了铝胁迫下根尖细胞壁高甲酯程度果胶含量,降低了低甲酯程度果胶含量,并显著降低果胶结合的铝含量。可见,铝诱导敏感小麦基因型(扬麦5号)根尖产生的高量NO,可通过提高果胶甲酯酶活性,降低果胶甲酯化程度,增加铝在细胞壁的积累,从而加剧铝对小麦根系产生的毒害效应。5.通过添加H2O2和NO供体和清除剂,研究了H2O2与NO在小麦根尖铝胁迫响应中的互作关系。结果表明,适当浓度的H2O2可以降低铝胁迫下小麦根尖的氧化损伤,缓解铝对根系伸长的抑制。H2O2供体可提高硝酸还原酶(NR)活性,并诱导铝胁迫下鉴-864和扬麦5号根尖NO的早期猝发;而H2O2清除剂或NADPH氧化酶抑制剂可抑制鉴-864根尖铝诱导的NO早期猝发和NR活性。一氧化氮合酶(NOS)抑制剂对铝胁迫下H2O2诱导的NO无显著影响,但NR抑制剂则完全抑制了铝胁迫下H2O2诱导的NO早期猝发。NO供体可缓解铝胁迫下H2O2清除剂对根系伸长的抑制,而H2O2供体不可以逆转铝胁迫下NO清除剂对鉴-864根系伸长的抑制效果。清除或抑制NO显著降低了铝胁迫下H2O2诱导的抗氧化酶活性,逆转H2O2对氧化损伤的缓解效果。表明铝胁迫下H2O2作为上游信号,诱导依赖于NR的NO早期猝发,提高植物体内抗氧化酶活性,降低ROS积累,从而增强小麦对铝毒胁迫的耐性。6.采用添加MAPK抑制剂、NO和H2O2供体等药理学方法,研究了H2O2、 NO和MAPK对铝胁迫诱导小麦根尖抗氧化酶活性的调控作用及其相互关系。结果表明,铝胁迫下耐性基因型鉴-864根尖抗氧化酶活性显著提高,而敏感基因型扬麦5号变化不大,MAPK抑制剂显著降低了鉴-864根尖抗氧化酶活性。H2O2和NO可以进一步提高铝胁迫下小麦根尖抗氧化酶活性,MAPK抑制剂则可显著抑制H2O2的作用效果,但对NO的作用效果无明显影响。进一步研究发现,MAPK抑制剂阻断了H2O2诱导的NR活性以及NO产生。表明,铝胁迫下根尖产生的H2O2可迅速激活MAPK级联,通过诱导依赖于NR的NO早期猝发,提高体内抗氧化酶活性,从而减轻铝对小麦根系造成的氧化损伤。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q945.78

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