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《浙江大学》 2014年
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DNA甲基化抑制剂5-Aza-2’-deoxycytidine处理后水稻的DNA甲基化研究

刘秋香  
【摘要】:DNA甲基化在诸如胚胎发育、基因转录、染色质的结构和稳定性、X染色体的失活、基因组印记、细胞的癌变和衰老等生物过程中起到关键作用。DNA甲基化模式和水平取决于DNA甲基转移酶和去甲基化酶的作用。DNA去甲基化包括DNA主动去甲基化和被动去甲基化。其中,DNA去甲基化酶在DNA主动去甲基化中起关键作用,而DNA被动去甲基化取决于DNA甲基转移酶的作用。迄今为止,对于DNA甲基转移酶基因的功能有着非常系统的研究。因此研究植物中DNA去甲基化酶基因对于利用该基因控制DNA的甲基化进而调控基因的时空表达具有重要的意义。本论文从水稻、高粱、拟南芥和毛果杨等四个物种的全基因组序列中鉴定DNA去甲基化酶基因,对其同源性、结构、表达和进化进行了系统的研究,并探究了其进化与功能的关系。另一方面,虽然通过突变体的研究已基本明确不同DNA甲基转移酶基因的功能,然而像组织培养、DNA甲基化酶抑制剂等在一定程度上可以影响DNA的甲基化,进而影响物种的表型,但究竟在多大程度上影响DNA的甲基化目前还无定论。利用不同浓度的DNA甲基化酶抑制剂(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)处理水稻种子以及诱导愈伤组织,并检测特定位点的DNA甲基化,试图探究DNA甲基化酶抑制剂在DNA去甲基化中的作用与特性。本论文的主要研究结果如下:1.以已知的10个DNA去甲基化酶基因为参照,从水稻、高粱、拟南芥和毛果杨的基因组中分别获得8、6、7、6个DNA去甲基化酶同源基因,基因数目相仿且在染色体中随机分布,而绝大部分基因在染色体上的位置是线性同源的。DNA去甲基化酶基因具有149个氨基酸的保守糖苷酶结构域序列,基于保守的糖苷酶结构域序列利用最大似然法构建的系统进化树可将该基因家族分为ROS1, DML3,DML4和DML5四个亚家族,其中DML4和DML5为新鉴定出的DNA去甲基化酶类似基因。2.虽然水稻和拟南芥中每个DNA去甲基化酶二级结构中的螺旋和片层数目虽然不同(总数在8-12个之间),但DNA去甲基化酶的二级结构的构相极其相似,说明它们其中的某些酶具有部分相同的功能。DNA去甲基化酶基因的表达具有组织特异性,并与其功能有一定关联。与其它组织相比,DNA去甲基化酶基因在水稻胚乳中的表达量较低,推测胚乳中的DNA的甲基化主要是被动去甲基化,与DNA去甲基化酶基因参与的主动甲基化关系不大。3.DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-dC处理会抑制水稻愈伤组织的生长,并随着浓度的升高而增强,达到一定浓度时甚至起到致死作用,再生得到的植株有矮化现象。但对种子进行处理时,植株表型没有明显变化,表明在不同的处理方式下,5-Aza-dC去甲基化的作用可能不同。4.组织培养可以降低DNA甲基化水平,RPBF基因经组培后其启动子的DNA甲基化明显降低,与胚乳组织的甲基化水平相当,而对RISBZ1基因的DNA甲基化几乎没有影响;5-Aza-dC处理只有在达到一定浓度时(10.0 μM)对RISBZ1基因有明显的DNA去甲基化作用,但对RPBF基因却没有影响;有意思的是,对愈伤组织进行5-Aza-dC处理,低浓度的5-Aza-dC(2.5μM)反而能够促进RPBF基因的DNA甲基化水平显著升高,随后与对照相仿,但对RISBZ1基因没有影响。表明组织培养和5-Aza-dC处理只对一些特殊位点的DNA去甲基化起作用,具有位点特异性。同时5-Aza-dC处理还具有甲基化的作用,具体原因有待实验进一步验证。5.DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-dC和组织培养可以对逆转座子Tosl7进行了DNA去甲基化使其发生再活化,然而我们的研究表明其对Tos17Chr10的DNA甲基化没有影响,表明DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-dC和组织培养作用下发生再活化的是Tos17Chr7。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:Q943

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