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《浙江大学》 2015年
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稻瘟病菌精氨酸合成途径基因的功能分析及稻瘟病菌代谢组学的研究

张勇  
【摘要】:稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)作为水稻重要病害稻瘟病的病原菌,每年在全球范围内造成巨大的粮食损失。由于该菌的经济重要性以及易于遗传操作,稻瘟病菌已逐渐变为研究病原真菌与植物互作机制的模式真菌。对于植物病原菌来说,感知营养条件信号并相应地作出代谢调整反应对于病原菌的成功侵染至关重要。稻瘟病菌是一种半活体营养真菌,在其致病侵染过程中,哪些营养物质来自宿主植物,哪些物质由稻瘟病菌自身合成以及特定的营养物质对稻瘟病菌致病性的影响是怎么样的,一直是稻瘟病菌研究需要解决的问题。(一)最近研究表明,一些基础性营养物质如氨基酸等对于稻瘟病菌的致病性是必需的。精氨酸(Arginine, Arg)作为真核生物中最具功能的一种氨基酸,不仅在蛋白合成,而且在氮代谢平衡、一氧化氮(NO)合成、尿素循环以及应对逆境胁迫等过程中都具有重要的作用。精氨酸合成途径在真菌中高度保守,但是对于它在稻瘟病菌中的功能还知之甚少。因此,本文对稻瘟病菌整个精氨酸合成途径进行了鉴定分析,并对其中三个基因(MoARG1、MoARG5,6和MoARG7)在稻瘟病菌生长、形态建成及致病侵染等过程中的功能进行了系统研究,主要结果如下:1)参照酿酒酵母以及其它生物中精氨酸的合成途径,通过同源比对分析,在稻瘟病菌中克隆了精氨酸合成途径的所有催化酶基因包括:MoARG1 (MGG_15868.7)、MoARG2 (MGG_01507.7)、MoARG3 (MGG_01102.7)、 MoARG4 (MGG_17278.7)、MoARG5,6 (MGG_02690.7)、MoARG7 (MGG_04210.7)、MoARG8 (MGG_11934.7)和MoargE (MGG_01970.7),并对这些基因的编码蛋白开展进化分析,结果显示精氨酸合成途径在真菌中高度保守。2) MoARG1、MoARG5,6和MoARG7分别参与了精氨酸合成途径的第七步、第二、三步反应和第五步反应。基因荧光定位发现MoARG1定位于菌丝、分生孢子以及附着胞的细胞质中,而MoARG5,6和MoARG7均定位于细胞的线粒体上。MoARG1、MoARG5,6和MoARG7在稻瘟病菌附着胞形成阶段表达量明显提高,表明这三个基因参与了附着胞的形成过程即附着胞的形成需要精氨酸的合成。3)基因敲除MoARG1、MoARG5,6和MoARG7,所得到的敲除突变体均表现为精氨酸营养缺陷型,其中突变体AMoarg7为不完全(渗漏)精氨酸营养缺陷型。它们在气生菌丝生长、黑色素积累、分生孢子产生、有性生殖以及致病性等方面均表现出严重缺陷且缺陷程度为AMoarg5,6AMoarg1AMoarg7。添加外源Arg,能够部分弥补各突变体的表型缺陷。4)大麦叶片穿透试验发现,Arg-突变体附着胞的侵染穿透出现延迟、穿透率严重下降且突变体侵染菌丝生长减弱并被限制在宿主细胞内无法扩展增殖,以上缺陷可能是导致Arg-突变体致病性丧失或减弱的原因。5)在稻瘟病菌中利用荧光探针检测了NO的产生,发现NO在孢子萌发及附着胞形成阶段大量产生。另外,探究了稻瘟病菌中精氨酸与NO产生的关系,NO在Arg-突变体中仍可以产生且外源补充NO不能恢复突变体的表型缺陷,从而表明,与动物细胞不同,稻瘟病菌中NO的产生不依赖于Arg/NO途径,还可能存在其它NO产生途径。(二)代谢组学作为一门新兴的技术科学,它能够全面检测生物样品中的小分子代谢物(MW1000)。本文以稻瘟病菌野生型菌株Guyll和细胞自噬突变体AMoatgl为研究菌株,以它们的菌丝、分生孢子、附着胞为研究对象,开展了各组织样品代谢组学的研究,主要结果如下:1)基于LC-MS和GC-MS两种技术平台,参照已有的植物、微生物代谢组学研究方法并进行优化,主要包括样品制备、代谢物的提取、仪器参数程序的调整、数据处理与分析等环节,建立了一整套稻瘟病菌代谢组学研究分析方法。2)与野生型Guy11相比,细胞自噬突变体AMoatgl菌丝、分生孢子以及附着胞中大部分的代谢物含量有所下降。这些化合物涵盖了糖类、氨基酸、多元醇以及脂类等。附着胞中的检测结果显示,AMoatgl附着胞内多种代谢物尤其是甘油的含量较野生型明显下降,这与AMoatgl附着胞中膨压下降、附着胞不能穿透以及致病性丧失的表型相吻合。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S435.111.41

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