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线粒体自噬的抗缺血性脑损伤作用及其调控机制研究

袁扬  
【摘要】:脑缺血是一种由于组织血流供应不足所引起脑组织损伤的神经系统疾病。缺血脑组织中的糖氧水平快速下降,导致组织细胞损伤,并最终影响神经功能。脑缺血严重危害着人类健康,目前尚无有效治疗手段。脑缺血病理过程十分复杂,缺血启动了多个细胞生物学过程,其中包括细胞自噬。自噬是指一种通过溶酶体途径降解细胞内大分子,回收利用多余或异常蛋白、细胞器的细胞内过程。自噬对于维持胞内稳态、应对应激状态非常重要,与多种人类疾病密切相关。近年的研究表明,细胞自噬可能也参与了脑缺血损伤的病理过程,然而其作用还存在争议:通过抑制自噬可以缓解局灶性脑缺血及神经退行性损伤,而另一些研究也提出了自噬可能具有神经保护作用。因此,自噬在缺血性脑损伤中的作用仍有待明确。此外,通过自噬途径降解细胞内损伤或多余线粒体称作线粒体自噬,脑缺血过程中伴随大量线粒体损伤,进而诱导细胞凋亡,损伤线粒体的清除有助于细胞存活。线粒体自噬的功能异常与多种神经退行性疾病的发生相关,然而在脑缺血中是否存在线粒体自噬还不明确,阐明其调控机制将为进一步利用线粒体自噬干预缺血性脑损伤提供重要依据。本课题旨在明确缺血性脑损伤过程中自噬的作用,重点探索该过程中线粒体自噬的发生及其对缺血脑损伤的贡献,并阐明其调控机制。第一部分自噬通过清除损伤线粒体保护小鼠脑缺血复灌损伤利用小鼠中动脉栓塞(MCAO)后血流复灌模型模拟脑缺血及其复灌过程。我们发现自噬在短暂性脑缺血(transient MCAO, tMCAO)复灌中被激活,给予自噬抑制剂3-MA能加重神经损伤,而在持续性脑缺血(permanennt MCAO, pMCAO)损伤中如果手术前给予3-MA,发现抑制自噬能够起到神经保护作用保护持续性脑缺血,提示自噬在脑缺血复灌前后作用不同,本课题首次发现其在脑缺血复灌过程中发挥神经保护作用。透射电镜实验结果显示,在小鼠脑缺血复灌3h后的半暗带区域,线粒体被自噬泡所包裹,并且复灌后线粒体标记蛋白TOMM20及COX4I1水平下调。Real-time PCR结果表明线粒体DNA编码基因Atpase 6下调,同样提示脑缺血复灌后存在线粒体自噬的现象。3-MA可增加tMCAO所致Cyt C的释放,提示自噬可能清除了损伤线粒体。通过线粒体分裂蛋白Drp1抑制剂mdivi-1抑制线粒体自噬,能加重小鼠脑缺血复灌损伤。进一步敲减线粒体自噬的重要蛋白Parkin,亦能加重氧糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation, OGD)所致神经元损伤。这些结果提示清除损伤线粒体可能是自噬在复灌过程中发挥保护作用的主要途径。上述研究表明线粒体自噬发挥抗缺血性脑损伤作用,进一步提示促进线粒体自噬可能是一种潜在的脑缺血治疗新策略。脑缺血过程伴随内质网应激,后者被证明通过多条信号通路激活自噬。因此,本课题研究的第二部分旨在明确脑缺血复灌过程中内质网应激是否可通过增强线粒体自噬发挥神经保护作用。第二部分适度诱导内质网应激通过选择性促进线粒体自噬发挥抗缺血性脑损伤作用小鼠MCAO复灌即刻侧脑室给予内质网应激诱导剂3μg tunicamycin (TM)和20 ng thapsigargin (TG),可显著减少24 h后脑梗死体积,缓解脑缺血引起的葡萄糖代谢降低并改善神经行为学症状。此外,TM和TG在OGD处理的原代培养神经元中同样发挥保护作用,并能被内质网应激抑制剂4-PBA逆转。TM和TG可剂量依赖地抑制OGD所致线粒体依赖的细胞凋亡。有意思的是,TM及TG均能在不影响自噬流的情况下进一步选择性加强线粒体自噬,促进缺血复灌后Parkin被招募至线粒体上。为明确线粒体自噬介导了内质网应激的上述保护作用,通过药理学和基因沉默手段阻断线粒体自噬(3-MA.Mdivi-1、ATG7 knockdown),发现可显著逆转TM和TG的保护作用。进一步对EIF2S1,ATF4,Parkin分别进行基因沉默,均能抑制线粒体自噬,逆转TM和TG的保护作用。利用Parkin敲除杂合子小鼠(Parki+/-)发现,TM的保护作用同样消失。以上结果表明,TM和TG可通过内质网应激信号通路PERK/EIF2S1/ATF4调控Parkin蛋白表达上调,促进其向线粒体转位并选择性上调线粒体自噬,最终通过清除损伤线粒体发挥抗缺血性脑损伤作用。线粒体自噬发生及调控的分子机制尚不清楚,本研究发现Parkin是脑缺血过程中重要的线粒体自噬调控因素。然而脑缺血中Parkin蛋白表达水平随着复灌时间延长而快速下降,而同时线粒体自噬仍旧维持在一个较高的水平,提示还有其它线粒体自噬的途径存在。Nix是一种线粒体外膜蛋白,被认为是一种重要的线粒体自噬受体,其对于红细胞发育过程中的线粒体自噬起到关键作用。本课题进一步探讨了Nix介导的线粒体自噬在脑缺血复灌中的保护作用。第三部分Nix通过非Parkin依赖途径调控线粒体自噬保护缺血复灌脑损伤为明确Nix是否参与脑缺血复灌过程中的线粒体自噬,我们利用Nix+/+,Nix-/-,Nix-/-三种小鼠进行MCAO手术,于缺血后复灌6h后检测缺血脑组织线粒体膜蛋白TOMM20和COX411水平。实验结果发现Nix敲除抑制缺血复灌引起的线粒体自噬,给予GFP-Nix腺相关病毒(GFP_Nix AAVs)可以逆转Nix敲除引起的线粒体自噬障碍,同时也逆转了Nix敲除引起的脑梗死增加。提示Nix参与了脑缺血复灌后的线粒体自噬并发挥保护作用。为探讨Nix介导的线粒体自噬在此过程中是否依赖于经典的Parkin途径,本课题在Parkin-/-小鼠脑内给予GFP_Nix AAVs,发现Nix高表达后仍能逆转Parkin敲除引起的线粒体自噬障碍并同样抑制其脑梗死体积增加。利用野生型小鼠,Nix-/-小鼠,Parkin-/-小鼠,Nix和Parkin共同敲除的小鼠(Nix-/- Parkin-/-, DKO),我们发现相较于Nix-/-或Parkin-/-小鼠,DKO小鼠的线粒体自噬水平显著降低,反映在线粒体膜蛋白TOMM20和COX4I1的下降,以及自噬标志蛋白LC3在线粒体上的比例减少,上述结果均表明了Nix是通过Parkin非依赖途径介导的脑缺血复灌过程中的线粒体自噬,提示Nix可能是干预缺血性脑损伤的潜在药物靶点。


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