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《浙江大学》 2016年
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微囊藻毒素LR通过激活Akt/mTORC1/S6K1通路促进肝细胞增殖

刘景辉  
【摘要】:背景:微囊藻毒素(microcystins, MCs)是一组单环七肽类化合物,由蓝藻的一些种属产生,在发生水华时被大量释放到水体中,可通过食物链进入动物及人体内进而威胁人类的健康。因此,微囊藻毒素的相关研究近三十年来一直是环境科学和预防医学的热点。目前已经报道的微囊藻毒素异构体有90多种,其中微囊藻毒素LR(microcystin-LR, MC-LR)是分布最广和毒性最大的一种,而肝脏是其最主要靶器官。MC-LR可以引发一系列的肝毒性,包括诱导肝细胞凋亡、坏死、肝肿大、肝出血和肝衰竭等。流行病学研究还表明MC-LR是一种促肿瘤因子,与原发性肝癌的发生密切相关。MC-LR发挥其毒性作用的主要机制是抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性,因此围绕MC-LR与PP2A的作用以及由此而产生的细胞学效应及病理学改变是揭示MC-LR致毒机制的关键。本实验室前期工作发现暴露MC-LR 24 h后,其可以在多种细胞中积累并抑制PP2A活性,进而影响多个骨架相关蛋白的磷酸化水平并引起细胞骨架改变,但多数细胞中没有检测到MC-LR诱导明显的细胞学效应。目的:PP2A是哺乳动物体内最重要的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,参与多种细胞活动的调控,其持续失活除了导致其有关底物的改变和相关信号通路的变化也应在细胞水平有所体现。因此,本研究以既有研究为基础,改变细胞暴露MC-LR的时间,进一步研究MC-LR对PP2A的影响,并以此探讨MC-LR引发的细胞效应及相关机制。在此基础上,用动物实验验证细胞实验中的发现。方法:以人肝细胞系HL7702为研究对象,暴露于1-10的MC-LR 1-72h,研究PP2A活性变化规律及相关机制,测定细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期等细胞学效应,对发生改变的细胞效应相关信号通路进行检测以探讨其机制。在细胞实验基础上,设计小鼠实验,暴露20-80 μg/kg的MC-LR 2h-4d,对相关的变化进行动物实验验证。结果:1.细胞实验(1) MC-LR在1h内迅速在HL7702细胞内积累并结合到PP2A/C亚基上,其结合量不随暴露时间的延长而增加。(2) MC-LR对PP2A酶活性的抑制呈浓度依赖性,在染毒24-72 h之间,PP2A相对活性保持在一定水平。(3) MC-LR诱导PP2A活性调节蛋白α4释放与其结合的PP2A/C亚基。(4) MC-LR暴露36h后可检测到其促进HL7702细胞增殖的效应。(5) MC-L R暴露直至48 h对HL7702细胞的细胞凋亡和细胞周期没有明显影响。(6) MC-LR暴露1h开始激活HL7702细胞内Akt/mTORCl/S6Kl通路,其中上游Akt的激活与PP2A活性的抑制共同参与MC-LR对S6K1的激活。(7)当Akt/mTORCl/S6Kl通路被抑制后,MC-LR诱导的细胞增殖消失。(8) MC-LR暴露1h开始诱导HL7702细胞内Bcl-2和Bad磷酸化水平升高。(9) MC-LR暴露1h开始激活HL7702细胞内周期蛋白依赖性激酶Cdk1。2.动物实验(1) MC-LR暴露2 h内在小鼠肝脏细胞内明显积累并结合到PP2A/C上,结合量不随暴露时间的延长而增加。(2) MC-LR对小鼠肝脏内PP2A活性的抑制与暴露浓度和时间相关。(3) MC-LR暴露诱导了小鼠肝脏PP2A活性调节蛋白α4释放其结合的PP2A/C,(4) MC-LR诱导小鼠肝脏细胞增殖。(5) MC-LR激活小鼠肝脏细胞内Akt/mTORCl/S6Kl及Akt/β-catenin信号通路。(6)本实验室前期研究已证实了MC-LR对HL7702细胞中ERK/JNK/p38通路的激活,本研究发现MC-LR也激活了小鼠肝脏中ERK/JNK/p38及其下游转录因子。结论:本研究用离体和活体实验相结合的方式证明了:1. MC-LR可以在短时间内在肝细胞内达到最大程度积累并结合到PP2A/C上,进而造成PP2A活性呈浓度和时间依赖性抑制。2. PP2A活性调节蛋白α4通过释放其结合的PP2A/C亚基在一定程度上减缓了MC-LR 对 PP2A活性抑制的程度。3. MC-LR能够诱导肝细胞过度增殖,其分子机制是MC-LR抑制PP2A活性导致的Akt/mTORCl/S6Kl通路的激活。另外,Akt/β-catenin和ERK/JNK/p38 MAPK可能也参与了这一过程。4. MC-LR引起的PP2A活性抑制虽然也引起了凋亡相关蛋白和周期相关蛋白水平的改变,但还不足以引起相关的细胞效应。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R114

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