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《浙江大学》 2016年
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基于量子点的荧光生物与化学传感器及其食品安全快速检测应用

徐李舟  
【摘要】:食品安全是全球公共性卫生安全问题,直接关系民生。近年来,食品安全恶性事件频发,食品安全问题逐渐成为社会焦点。在全球范围内,由食品安全引起的问题和疾病,不仅造成严重的经济损失,而且极大地危害了人们的生活健康水平,因此研究食品安全快速、准确的检测方法,以预防和控制危害事件的发生,具有重要的现实意义和社会价值。生物与化学传感器,是一个活跃的科学研究和工程技术领域,它共享生物学、化学、免疫学、物理学、电子学、材料学、信息学、以及微机电系统(MEMS)等学科,处在生命科学和信息科学的交叉区域。生物与化学传感器具有高选择性、高准确性、分析快捷、操作简单等优点,是一种先进的检测技术与方法。作为常用的光学检测手段之一,荧光检测灵敏、快速、便捷,检测仪器设备成熟,已被广泛应用于各类检测方法和仪器设备的科研开发中。纳米材料发展于20世纪80年代,具有独特的物理化学特性与广阔的应用前景,因而享有广泛美誉。纳米技术与材料应用于生物传感器的研发,将带来新的发展契机,创造更为广阔的应用空间。量子点(Quantum Dots, QDs)是一种新兴的纳米发光材料,常作为荧光标记物被广泛用于生物传感和细胞成像;同时它又是一种半导体的纳米晶粒,由于其具有独特的性质,比如尺寸可调、光学信号强、荧光量子产率高、光学性质稳定等,近年来在生物传感领域备受青睐。本论文将纳米技术与光学检测传感技术相结合,开发新型的生物/化学传感器,综合运用各学科不断进步的技术优势以提升其性能,并应用于食品安全快速检测领域。本文主要研究内容、结果和结论如下:(1)用于快速检测食用油掺假的功能化水溶性量子点荧光淬灭传感器针对劣质食用油掺假问题,特开展利用纳米生化传感检测的方法,对其进行快速鉴别。选用量子点作为纳米荧光探针,当加入被测物一“地沟油”勾兑的劣质食用油时,被测物中某些成分如重金属离子、有机小分子、碳碳共轭双键(C=C)、吸电子基团、自由基等(淬灭剂)可以淬灭量子点的荧光。不同掺杂比例的劣质食用油中含有不同浓度的淬灭剂,从而引起不同程度的荧光淬灭,宏观上表现出不同的荧光强度,由此建立淬灭率与劣质食用油中“地沟油”掺杂比例之间的定量关系。模拟人工勾兑方法,将毛“地沟油”以0.4、2、6、10%的比例掺入某合格食用植物油中,配制成不同掺杂比例的劣质食用油,然后用量子点荧光淬灭法鉴别劣质食用油。结果发现劣质食用油对量子点荧光的淬灭率随着其掺杂浓度的增加而增大。将不同劣质食用油对量子点荧光的淬灭率与掺杂比例作图,可以发现两者之间呈现较好的线性关系(y=5.96x+14.99;R2=0.94)。因此,该基于功能化水溶性量子点荧光淬灭传感器可在2 min内对掺假0.4%及以上的劣质食用油进行快速鉴别,具有很大的现场应用前景。(2) 用于于-快速检测禽流感病毒的基于于-DNA智能响应水凝胶的荧光适配体传感器建立了一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器。选择对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配体作为生物识别元件,通过对其5’末端修饰丙烯酰胺基(Acrydite),对其3’末端修饰修饰荧光淬灭基团Iowa Black(?) RQ,进行功能化修饰;针对性设计可与核酸适配体序列互补的单链DNA1和单链DNA2,并在单链DNA1的5’末端修饰丙烯酰胺基,在单链DNA2的5’末端修饰荧光量子点;丙烯酰胺基修饰的DNA链在引发剂的催化下能够聚合形成含有多条DNA支链的聚丙烯酰胺链;核酸适配体与单链DNA1之间的碱基互补配对发挥了交联剂的作用,使两种聚合物链相互连接,从而形成水凝胶;当不存在目标病毒时,由于DNA链之间的杂交作用,凝胶处于收缩状态,量子点由于距离淬灭剂很近其荧光被淬灭;而当存在目标病毒时,适配体与目标病毒的结合导致DNA链之间的杂交被分解,使得凝胶溶胀,造成量子点与淬灭剂之间的距离增大,从而量子点荧光被恢复。结果表明该荧光适配体传感器的检测时间小于30min,最低检测限为0.2 HAU,线性范围为2-2.3 to 26 HAU/20μL-1。因此,所研究的简便、廉价、高特异性的适配体传感器在现场快速检测禽流感病毒H5N1中具有较大的应用前景。(3)用-于-同时检测四种食源性致病菌的结合免疫纳米磁分离的荧光生物传感器及便携式荧光生化快速检测仪的现场应用在食源性致病菌的检测中,同时检测多元细菌具有很大的需求和发展潜力。本课题结合免疫纳米磁分离技术作为样品分离和富集手段,利用纳米荧光量子点作为荧光信号报告分子,研究了一种快速、专一的可同时分离和定量检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等四种食源性致病菌的荧光适配体传感器。本文采用可查文献中粒径最小(25 nm)的纳米磁珠,其分别交联四种特异性抗体后可在45 min内从复杂食品基质中同时捕获四种目标细菌,并在磁场作用下实现同时分离。将四种不同的链霉亲合素修饰的量子点分别交联上生物素化的特异性核酸适配体,用于对目标细菌的荧光标记。通过便携式荧光光谱仪读取荧光信号,从不同的荧光发射波长可以定性地判断不同的目标细菌,而从荧光强度则可定量反应多种目标细菌的浓度,从而实现同时检测。扫描电子显微镜和荧光共聚焦显微镜用于表征免疫磁珠捕获到的细菌和“磁珠-细菌-量子点”的“三明治”结构。通过有限元分析,模拟了磁场的特性,并建立了免疫磁珠捕获细菌进行磁分离的数学模型。结果表明,对大肠杆菌0157:H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的磁分离效率分别达到90.4%、87.5%、92.0%和92.0%,在纯培养物中的方法检测限分别达到80、100、47和160 CFU/mL,在牛肉样品中的方法检测限为320、350、110和750 CFU/mL。本文研究的适配体荧光传感器能够在2.5 h内对10’至104 CFU/mL的四种食源性致病菌进行同时分离富集和定量检测,展示了该技术在致病微生物多元检测现场应用中的极大潜力。另外,针对沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特菌等常见食源性致病菌,选取具有高度特异性和灵敏度的抗体制备生物传感材料,结合免疫纳米磁分离技术,利用所研究的可同时快速分离和检测多元食源性致病菌的荧光生物传感方法,对食品中常见的致病菌进行检测,验证了合作单位研制的病原菌检测用便携式荧光生物传感检测仪器的可行性。纳米磁珠分别交联三种特异性抗体后可同时捕获目标细菌,在磁场作用下实现同时分离。将分离物分别标记上三种偶联有抗体的荧光量子点,即可进行荧光信号的读取,从而实现了对多种目标细菌的同时快速检测。采用该仪器检测,总检测时间(定义为取样前期处理一直到测定结果读出的时间总和)少于60 min。应用此技术,可实现肉品、蔬菜、水产品等食品在物流与销售过程中的现场、在线监测和快速预警,将有效避免致病菌感染等危险食品安全事件的发生,有效提高食品安全水平。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:TS201.6;O657.3

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