收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

结直肠癌细胞与微环境相互作用诱导上皮间质转化过程中差异表达基因的筛选及初步鉴定

李辉  
【摘要】:根据美国癌症协会的统计数据,每年美国死亡人口中每四人有一人死于癌症,全球数据也显示,恶性肿瘤的发病率及死亡率不断升高,成为降低人类生存质量、威胁人类健康的首要因素。决定癌症病人生存和预后的关键因素为远处转移和治疗耐药,但转移和耐药的确切机制并不完全清楚。近年来的研究提示,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程发挥重要的作用。EMT是上皮细胞受到自身及外界环境影响,逐渐失去上皮表型,向间质细胞形态转变的过程,包括细胞失去上皮极性;E-cadherin(CDH1),occludin(OCLN)等上皮标志物表达水平降低;N-cadherin(CDH2),vimentin(VIM),fibronectin(FN1)等间质标志物表达升高;细胞间连接减少;细胞获得迁移和侵袭能力等等。发生EMT的肿瘤细胞同时获得了一定的干性(sternness)特征,有利于肿瘤细胞发生远处转移及抵抗化疗药物细胞毒性。EMT的发生机制非常复杂,多种分子和信号通路参与了 EMT的发生。EMT的发生也受到肿瘤微环境中各种间质细胞及成分的调控。肿瘤芽是位于肿瘤浸润前缘的单个肿瘤细胞或者细胞数量小于5个的肿瘤细胞团。肿瘤芽多少与病人的预后有关,数量多预后差。肿瘤芽是EMT在实体瘤内的形态学表现。因此肿瘤芽是研究人体肿瘤细胞与间质微环境相互作用的理想模型。本课题的目的是筛选和鉴定肿瘤细胞及其微环境相互作用诱导EMT过程中的差异基因,为阐明EMT形成机制提供基础。该研究分以下4个部分。1结直肠癌细胞及其微环境中EMT差异表达基因的筛选我们选取新鲜结直肠癌手术标本,经过病理切片初筛之后,利用激光捕获显微微切割技术精确分离结直肠癌浸润前缘单个肿瘤芽细胞及芽周间质成分,利用表达谱芯片筛选EMT差异表达基因。通过t-test统计分析方法筛选肿瘤芽中差异表达基因(P0.05;fold change≥2或≤ 0.5)。结果显示,肿瘤芽中有494个差异表达基因,其中表达上调基因432个,表达下调基因62个。我们先基于文献中EMT相关调控因子数据构建EMT调控网络,利用皮尔森相关系数计算494个差异基因与已知EMT调控因子的相关性,而后根据蛋白质-蛋白质相互作用网络将肿瘤芽中494个差异表达基因富集到已构建好的EMT调控网络中,得到49个与已知EMT调控因子有蛋白质相互作用的基因。以肿瘤芽间质成分为实验组,中心癌细胞间质及正常肠上皮细胞间质成分为对照组,筛选肿瘤芽间质微环境中差异表达基因(筛选标准为fold change ≥ 2或≤0.5)。结果显示,肿瘤芽间质中有3495个差异表达基因。对这些差异基因进行分析,同样我们利用皮尔森相关系数计算差异基因两两之间的相关性、根据蛋白质-蛋白质相互作用数据将肿瘤芽间质中3495个差异基因富集到已构建好的EMT调控网络中,得到66个与已知EMT标志物有关联的基因。为了进一步探索EMT调控机制,筛选EMT发生发展过程中的关键调控因子,我们对表达谱芯片数据进行了深入的数据挖掘。将正常、中心癌细胞、肿瘤芽作为肿瘤发生发展过程中的3个阶段,分别构建每个阶段的转录调控网络。利用构建好的正常肠上皮细胞、中心癌细胞以及肿瘤芽三个阶段的共表达网络,取3个阶段中基因-基因两两比较的差异基因的并集,将这些基因分别对应到正常、中心癌细胞、肿瘤芽3个阶段的基因表达值,计算每个阶段中基因与基因之间的相关系数,然后计算出基因覆盖拓扑关系(topological overlap)。利用平均链接层次聚类方法(average linkage hierarchical clustering)基于 topological overlap 得到不同的基因簇,即表达模式相似的基因。比较三个阶段的基因簇,找出肿瘤芽中特有的5个基因簇(PC1_var0.90,density0.7)。每个基因簇中的基因作为候选基因进行验证。为了深入探究EMT发生过程中各路调控因子,我们将肿瘤芽中差异表达基因进行功能注释,从中筛选出EMT发生过程中炎症、表观遗传、代谢调控相关基因,以及EMT相关调控肿瘤细胞干性形成和肿瘤耐药基因。将这五个方面的差异基因基于KEGG数据库进行搜索,利用KEGG数据库中的基因-基因相互作用关系,构建差异基因间相互作用网络。其中,筛选到炎症相关基因56个;表观遗传相关调控基因80个;代谢相关基因95个;肿瘤细胞干性相关基因87个;肿瘤耐药相关基因17个。2筛选得到差异表达基因在结直肠癌组织中的初步验证我们利用Nanostring nCounter system针对以上表达谱芯片筛选得到的差异表达基因进行初步验证,明确筛选结果的可靠性。具体过程是,显微微切割精确分离单个肿瘤芽及其周围间质成分,获得RNA后,进行Nugen线性扩增。cDNA产物进行nCounter检测。根据第一步差异表达基因的系统性生物信息学分析,我们筛选出268个基因进行验证,包括从肿瘤芽及其间质成分中筛选出的202个基因,以及66个文献已经开展研究、并认为参与EMT调控的EMT标志物(设计上作为一种对照)进行检测。候选基因在肿瘤芽中的验证一致性为82%(220/268),在肿瘤芽间质中的验证一致性为83%(222/268)。对肿瘤芽及其间质中验证一致的基因根据表达差异倍数(ratio)进行筛选,共得到106个基因(ratio2-2)。在这些基因中,18个基因在肿瘤芽及其间质中均有表达差异,IL6,GAB1,VANGL1在肿瘤芽及其间质中表达均上调,揭示了此18个基因可能在肿瘤芽及其微环境对EMT的交叉调控中发挥重要作用。我们将nCounter验证一致的106个来自于肿瘤芽及其间质成分的基因进行EMT调控网络构建,基于KEGG数据库及蛋白质相互作用网络构建了肿瘤芽-微环境调控网络,系统分析了 EMT发生发展过程中基因的交叉调控作用。我们发现:肿瘤芽中的差异表达基因C4V1/2,ITGAITCF/LEF,KIT;肿瘤芽间质中的差异表达基因PTPRM,MURF2,SMAD4,RUNX1T1,SRC,GRB;以及肿瘤芽及其间质微环境中共有的差异表达基 因 PTPRF,FUS,DCN,LTBP1,INHBA,SMAD2/3,ARHGAP5,IL6,PARD6A,WAS,ITGB,ROH4,MET,IMET,KRAS,MMP1富集在EMT调控网络中,揭示了通过这些差异基因发挥作用的信号通路在肿瘤细胞及其微环境中发挥重要的交叉调控作用。这些基因功能的深入研究对阐明EMT的机制提供了新的思路和潜在药物作用靶点。为了进一步分析nCounter技术初步验证得到的106个差异基因与肿瘤药物靶向结合的可能性,我们选择了 131个肿瘤药物用来进行基因-药物靶向结合分析。我们对基因及肿瘤药物进行了富集分析,利用超几何分布检验对得到的基因与肿瘤药物靶向结合进行检验;对于基因与肿瘤药物靶向结合事件小于5的,采用fisher精确检验。我们发现:与肿瘤药物GSK269962A有靶向结合作用的基因有ACTA2,BGN,EHD2,FN1,LGALS1,THBS2,IGFBP7,MMP2,OLFML3(P0.0001);与肿瘤药物阿西替尼(Axitinib)有靶向结合作用的基因有BGN,CDH1,CLCA1,TBXA2R,MET,PDGFRA(P = 0.017);与肿瘤药物尼洛替尼(Nilotinib)有靶向结合作用的基因为MEF2C,TBXA2R(P=0.036)。3潜在EMT标志物在结直肠癌细胞系中的验证为了进一步验证肿瘤芽及其间质中筛选出的潜在标志物,我们基于nCounter技术在结直肠癌组织中的初步验证结果选择在肿瘤芽及其间质微环境中均有表达差异、且差异倍数较大的基因LGALS1及MMPs家族成员MMP1作为候选基因进行细胞系中的验证。利用经典EMT诱导因子TGFβ和TNFa诱导结直肠癌细胞系HT29和SW480发生EMT。我们发现MMP1和LGALS1在发生了 EMT的两株结直肠癌细胞系中表达升高,揭示MMP1和LGALS1在结直肠癌细胞EMT发生过程中可能发挥重要调控作用。4潜在EMT标志物在结直肠癌组织中与经典EMT标志物的关系分析及预后分析为了探究候选基因LGALS1,MMP1与肿瘤细胞发生EMT的相关性,我们利用7例病人来源的结直肠癌组织浸润前缘的肿瘤芽(实体瘤内EMT的形态学表现)基因表达数据分析了候选基因与经典EMT标志物CDH1,CDH2,SNAI1,TWIST1,以及ZEB1的表达相关性。我们发现:LGALS1与ZEB1具有很强的正相关性,且在肿瘤芽中表达趋势一致(r = 0.821;P = 0.023);MMP1与CDH2具有很强的正相关性,且在肿瘤芽中表达趋势一致(r = 0.891;P = 0.007);此外,LGALS1与CDH1具有比较强的表达负相关性(r =-0.536)、与SNAI1(r = 0.607),TWIST1(r = 0.523),VIM(r = 0.571)有较强的表达正相关性。MMP1与TWIST1具有较强的正相关性(r = 0.555)。根据LGALS1,MMP1在结直肠癌组织样本中的检测结果,我们去掉每个基因对应的样本中有缺失值的项。最终留取83例样本进行MMP1的预后分析;82例样本进行LGALS1的预后分析。与正常对照组相比,LGALS1,MMP1在结直肠癌组织中的表达水平升高(P0.05)。并利用临床资料分别分析LGALS1,MMP1与结直肠癌患者生存预后的相关性。我们发现,LGALS1(P= 0.032)和MMP1(P=0.006)均是结直肠癌患者预后指标(LGALS1和MMP1高表达结直肠癌患者预后差)。综合上述研究结果,我们得出以下结论:(1)通过新鲜结直肠癌组织肿瘤芽显微切割、表达谱芯片分析、系统性生物信息学数据挖掘及结直肠癌组织中的初步验证,我们在肿瘤芽及其间质徽环境中筛选到106个潜在EMT标志物;通过构建106个差异基因的EMT调控网络,我们分析了肿瘤细胞及其间质微环境对EMT的协同调控作用;并分析和预测了 15个潜在EMT标志物与3种肿瘤药物的靶向结合作用。这是国际上首次利用病人来源的结直肠癌标本研究癌细胞与间质微环境相互作用调控EMT,所取得的大量数据为深入研究EMT的调控机制提供了基础。(2)在结直肠癌细胞系中的验证发现,MMP1和LGALS1在发生EMT的结直肠癌细胞系中表达升高,揭示候选基因与结直肠癌EMT的发生具有相关性。(3)利用结肠癌组织进行候选基因与经典EMT标志物的关系分析,我们发现LGALS1和MMP1分别与多个经典EMT标志物有表达相关性,提示这两个基因参与结直肠癌EMT过程的调控。且LGALS1和MMP1均是结直肠癌患者的预后指标,LGALS1和MMP1高表达结直肠癌患者预后差。再者,LGAS1与肿瘤药物GSK269962A有潜在靶向结合,我们推测LGALS1可能会是肿瘤治疗的潜在靶点。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前14条
1 沈俊;袁平;李波;张焕鑫;赵继先;王家宁;;上皮间质转换研究进展[J];湖北医药学院学报;2017年05期
2 王艳俊;蒋永新;刘珊;王红;;同期放化疗诱导人结直肠癌细胞发生上皮-间质转化[J];临床与病理杂志;2017年01期
3 张玉峰;叶坤英;张广玉;刘新爱;;结直肠癌细胞周期的研究[J];中国地方病防治杂志;2016年11期
4 苟青;何先东;吴胜海;;双氢青蒿素对人结直肠癌细胞的体外作用[J];肿瘤药学;2011年06期
5 杨光之,丁彦青,李祖国,张进华;Kail/CD82在转移能力不同结直肠癌细胞系的表达[J];中华病理学杂志;2003年05期
6 张义平;郑美蓉;殷嫦嫦;吴萍;周许峰;吴建芳;周小鸥;;热休克诱导结直肠癌细胞外泌体的免疫效应[J];肿瘤防治研究;2011年07期
7 胡祥;程勇;王吉明;刘彬;;结直肠癌细胞系肿瘤干细胞相关亚群初步研究[J];重庆医科大学学报;2008年12期
8 杨祖立;康亮;黄美近;王磊;彭俊生;向军;兰平;汪建平;;结直肠癌细胞中脾酪氨酸激酶基因甲基化状态和表达的关系[J];中国病理生理杂志;2008年09期
9 Baskaranathan S. ,Philips J. ,McCredden P. ,Solomon M.J.,王志宇;腹膜表面游离结直肠癌细胞:与病理类型和生存率的关系[J];世界核心医学期刊文摘(胃肠病学分册);2005年06期
10 兰晓军;姚晖;王明明;左强;张强;徐亮;;结直肠癌细胞和组织Epac1表达临床意义[J];中华肿瘤防治杂志;2018年07期
11 白雪;于波;苑树俊;左富义;孙亮;;洛铂和奥沙利铂对结直肠癌细胞系生物学行为影响的实验研究[J];临床肿瘤学杂志;2009年08期
12 崔澂;傅占江;贡树基;胡建军;李金生;郑文广;;结直肠癌细胞所致免疫抑制及免疫抑制分子分泌模式的研究[J];白求恩军医学院学报;2012年01期
13 耿焱;姜泊;王伟;马强;;四分子交联体5表达上调对结直肠癌细胞转移能力的促进作用观察[J];解放军医学杂志;2010年06期
14 笪正;;上皮-间质细胞转化的分子机制及其在肿瘤转移中的作用[J];中外医学研究;2011年29期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 熊伟;蒋永新;刘珊;王红;谢青;;体外同期放化疗抵抗结直肠癌细胞模型的建立及其长链非编码RNA表达谱的变化[A];全国肿瘤流行病学和肿瘤病因学学术会议论文集[C];2015年
2 林洁;李婷婷;王博;金贺;丁彦青;;转移相关基因Tiam1启动子高甲基化抑制结直肠癌细胞生长与侵袭[A];第九届全国肿瘤转移学术大会暨2011年黑龙江省医学会肿瘤学年会摘要集[C];2011年
3 张月宁;鲁重美;吴海燕;陈原稼;;S100P在人结直肠癌中表达的临床意义及其对结直肠癌细胞生物学行为的影响[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议教育集[C];2006年
4 胡若磊;张素梅;周青;汪渊;;褪黑素对结直肠癌细胞RKO增殖和迁移抑制作用的初步研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会-2011年学术交流会论文汇编[C];2011年
5 常环环;李文帅;杨姝;孙海梅;季凤清;吴波;孙婷怡;周德山;;白藜芦醇通过上调miR-34c表达抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭[A];中国解剖学会2015年年会论文文摘汇编[C];2015年
6 汪桂华;王惠民;;结直肠癌细胞APRIL的异常表达促进肿瘤的生长和转移[A];中华医学会第七次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2012年
7 罗金燕;齐惠滨;;Cajal间质细胞的功能与疾病[A];中华医学会2001年全国胃电图和胃肠动力研讨会论文摘要集[C];2001年
8 刘莉;丁彦青;;Tiam1基因表达沉默后对结直肠癌细胞蛋白表达谱的影响[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议教育集[C];2006年
9 徐峰;;细胞力学微环境工程[A];第二届全国生物力学青年学者学术研讨会摘要集[C];2016年
10 张学工;;生物信息学[A];2007-2008控制科学与工程学科发展报告[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李辉;结直肠癌细胞与微环境相互作用诱导上皮间质转化过程中差异表达基因的筛选及初步鉴定[D];浙江大学;2015年
2 程康文;长链非编码RNA Gas5通过miR-182-5p对结直肠癌细胞增值、凋亡影响的研究[D];南京医科大学;2018年
3 程利鹏;肝炎微环境中IRF-1调控结直肠癌细胞let-7a簇表达降低肝转移能力的机制研究[D];中国人民解放军海军军医大学;2018年
4 穆昱;FAM83D对结直肠癌细胞生物学功能的影响及其分子机制的初步研究[D];郑州大学;2018年
5 黄培;DDX46在肠癌中的生物学功能及辐射敏感性研究[D];苏州大学;2016年
6 王运刚;粒细胞样髓源性抑制细胞来源exosomes调节结直肠癌细胞干性的机制研究[D];江苏大学;2018年
7 许颖华;P53抑制Fascin蛋白活化进而抑制结直肠癌转移的分子机制研究[D];浙江大学;2018年
8 刘姣;MORC2下调NDRG1在结直肠癌细胞恶性表型中的作用及机制[D];中国医科大学;2018年
9 兰静芩;SIRT1调控PKM2乙酰化对结直肠癌细胞糖代谢的作用及机制研究[D];华中科技大学;2018年
10 李海杰;1.KDM4B在结直肠肿瘤葡萄糖代谢中的功能及机制研究 2.腹腔镜右半结肠切除术D3+CME术式的技术要点、外科学效果及解剖基础研究[D];华中科技大学;2018年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 崔垄臻;G9A调控结直肠癌细胞生长及其相关机制研究[D];河南大学;2018年
2 张朋飞;B7-H3分子介导的结直肠癌细胞耐药机制的探究[D];江南大学;2018年
3 任延松;TUSC3基因调控结直肠癌细胞干性和耐药性的作用及分子机制研究[D];南方医科大学;2018年
4 李月侨;下调FOXK1表达对结直肠癌细胞系SW480基因表达谱的影响[D];南方医科大学;2018年
5 胡水清;过表达Twist1促进结直肠癌细胞SW620获得多药耐药性的研究[D];遵义医学院;2018年
6 朱德华;ZC3H13通过抑制Ras-ERK信号通路调控结直肠癌细胞的增殖和侵袭[D];中国医科大学;2018年
7 吴延婷;miR-320a对结直肠癌细胞生物学行为的影响及下游靶基因鉴定[D];昆明理工大学;2018年
8 朱孝辉;DAB2IP/hnRNPK/MMP2信号轴调控结直肠癌细胞侵袭和转移的分子机制[D];南方医科大学;2015年
9 张园莲;抑制结直肠癌细胞HT-29增殖的益生菌筛选及其作用机理研究[D];昆明理工大学;2018年
10 王茹;黍子过氧化物酶诱导结直肠癌细胞Necroptosis的机制[D];山西大学;2018年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 王璐;改善微环境是脑损伤修复与重建的关键[N];科学时报;2011年
2 69241部队 陈辉;激活“微环境”的正能量[N];解放军报;2018年
3 中科院大学博士生 魏伟佳;年轻而大有可为的生物信息学[N];中国青年报;2016年
4 刘义;生物信息学产业浮出水面[N];中国高新技术产业导报;2000年
5 刘海;“微环境”时刻影响儿童健康成长[N];新华每日电讯;2003年
6 李斌;我国科学家“解读”生命奥秘[N];科技日报;2001年
7 记者 王雪飞;我国科学家向政府建议——加强生物信息学学科建设[N];健康报;2000年
8 王宏;高性能计算应用于生物信息学领域[N];中国计算机报;2003年
9 张雅丽;加强交流 立足中国生物信息学最新进展[N];科技日报;2000年
10 本报记者 白毅;生物信息学院士谈[N];中国医药报;2002年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978