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谷胱甘肽双功能合成酶的定向进化及酶法合成谷胱甘肽的研究

刘晓冬  
【摘要】:谷胱甘肽(GSH)是一种具有多种重要生理功能且市场需求量巨大的活性小肽。目前利用基因工程改造的高产菌虽已实现GSH的工业化生产,但仍存在产物胞内抑制、分离纯化成本较高等问题。本课题首先从Streptococcus agalactiae中克隆谷胱甘肽双功能合成酶基因gshFSA,将其在大肠杆菌中进行重组表达和分离纯化并开展了酶学性质研究,然后建立了 一种基于抗砷离子压力的酶活高通量筛选方法,利用定向进化提高GshFSA的酶活性。在此基础上引入E.coliK-12的乙酸激酶ACK构建ATP再生体系,开展GshFSA-ACK双酶偶联催化合成GSH的研究。(1)从Streptococcus agalactiae中PCR得到谷胱甘肽双功能合成酶基因gshFSA,构建重组表达载体pET28a-gsshFSA,转化入E.coli BL21(DE3)获得重组菌。优化重组蛋白的表达条件:在对数生长中期(3.5 h,OD600≈1.5),加入0.2 mMIPTG进行诱导,25℃培养8h,酶活可达293U/L。利用Ni-NTA亲和层析纯化目标蛋白,酶活回收率达到70.8%,纯化后的GshFSA的比酶活达到1.734 U/mg,是粗酶的13.6倍。进一步优化GshFSA酶催化反应条件,确定了最适温度(37℃)和pH值(8.0),以及最适的ATP浓度(10 mM)和Mg2+浓度(40 mM)。(2)采用Red同源重组技术构建了 gshA缺陷型菌株(E.coli W3110/△gshA),建立了一种基于抗砷离子压力的酶活高通量筛选方法。利用易错PCR构建目标基因突变库,经筛选获得5个比酶活和Km(Glu)均有一定提升的突变株M1-M5。其中突变体M5的比酶活提升了 117.9%,达3.77U/mg,Km(Glu)缩小为野生型的1/3左右。通过比较酶学性质发现突变体M5的最适温度和pH均没有明显变化,且对GSH的反馈抑制也不敏感,其kcat/Km从野生型的2.41s-1mM-4提高到8.59s-1mM-1。(3)克隆来源于E.coliK-12的乙酸激酶基因ack,构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-ack,经IPTG诱导表达和Ni-NTA亲和层析纯化获得ACK蛋白。纯化后的ACK比酶活达到114.5U/mg,是粗酶液的14.08倍。利用ACK催化ADP再生ATP,反应平衡时ADP和ATP摩尔比为1:41,ADP的转化效率达到了 94.6%。在GshFSA催化合成GSH的反应体系中偶联ACK介导的ATP再生系统。在1mL反应体系中,1h后GSH产量达到3.09g/L,ATP的再生循环次数约为3.02。在1 L反应体系中,3 h后GSH的产量达到12.64 g/L(41.13 mM),GSH的产率为4.21 g/(L ·h),半胱氨酸的转化率达到51.4%,ATP的再生循环次数约为7.25。


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