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《浙江大学》 2019年
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蝶蛹金小蜂两种幼虫唾液蛋白分子特性及其功能初探

梅耀天  
【摘要】:寄生蜂是农业害虫生物防治的重要天敌昆虫资源,在自然界中种类繁多。目前本实验室的研究集中在寄生蜂雌蜂所携带的,能够对寄主天然免疫反应等一系列重要生理过程起到调控作用的一些关键寄生活性因子,如毒液,多分DNA病毒(PDVs)等,但对寄生蜂幼虫分泌的活性物质诸如唾液的组分,功能及其与寄主天然免疫反应的相互作用的研究较少。现对昆虫唾液蛋白的研究主要集中在植食性昆虫和吸血性昆虫,它们的唾液蛋白具有抵御植物防御反应,充当植物-昆虫间效应子,协助传播病毒等作用。本实验室蝶蛹金小蜂(Pteromalus puparum)幼虫唾液的初步研究结果表明它具有抑制寄主血淋巴黑化的作用,即可能调控寄主害虫天然免疫。有鉴于此,本论文制备唾液蛋白组并对唾液组分及富集途径进行了鉴定分析;结合幼虫唾液腺转录组数据选取两个具备信号肽和特异高表达的唾液蛋白编码基因,而后进行基因克隆,表达模式的分析和对其功能研究体系的初步探索。1、蝶蛹金小蜂幼虫唾液蛋白质组的分析通过对蝶蛹金小蜂幼虫唾液蛋白质组的分析,共鉴定到38个唾液蛋白。根据序列和结构域信息分为蛋白酶、蛋白酶抑制剂、识别与结合蛋白、碳水化合物代谢,酯酶,其他蛋白和未知蛋白。并对它们进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析。利用蝶蛹金小蜂幼虫唾液腺转录组数据筛选出在幼虫唾液腺中高表达的508个基因,结合蛋白质组的分析结果,最终选择了两个具有信号肽且特异高表达的蝶蛹金小蜂幼虫唾液蛋白编码基因进行后续实验。2、两个幼虫唾液蛋白编码基因的克隆和表达模式分析通过序列比对从蝶蛹金小蜂基因组中得到PP05924和PP16911的CDS全长,对其进行序列分析和进化树分析,结果表明PP05924开放阅读框1884bp,编码628个氨基酸,预测分子量为75KDa,具信号肽。进化分析表明,PP05924与短管赤眼蜂(Trichogramma pretiosum)的arylphorin-like(XP_014234947.1)亲缘关系最近。PP16911开放阅读框459bp,编码153个氨基酸,预测分子量为18.5KDa,具信号肽。进化分析表明,PP16911与两未知功能蛋白亲缘关系最近。而后成功克隆得到这两个基因去信号肽后的编码区,并采用PcoldI表达系统对它们进行原核表达,纯化,透析并制备多克隆抗体。荧光定量PCR和Western blot分析结果表明,PP05924基因在幼虫期第五天(简写为L5)高表达。对L5期的蝶蛹金小蜂各组织进行荧光定量PCR和Western blot分析结果表明,无论是在mRNA水平还是蛋白水平上,PP05924在唾液腺,唾液和肠道中均显著高表达。对成虫期第一天(简写为A1)的蝶蛹金小蜂各组织进行定量分析结果表明,PP05924在唾液腺中显著高表达。同样对PP16911基因进行上述分析结果表明,PP16911基因也在L5期高表达。对L5期的蝶蛹金小蜂各组织进行荧光定量PCR和Western blot分析结果表明,无论是在mRNA水平还是蛋白水平上,PP16911在唾液腺及唾液中均显著高表达。对A1期的蝶蛹金小蜂成虫各组织进行定量分析结果表明,PP16911在唾液腺中显著高表达。3、幼虫唾液蛋白的功能研究体系初探由于蝶蛹金小蜂两个幼虫唾液蛋白编码基因均在L5期特异性高表达,成虫期表达量低,故通过向寄主蛹注射dsRNA的方法来干扰唾液蛋白基因,达到建立幼虫高表达基因功能研究体系的目的。实验结果表明,在蝶蛹金小蜂幼虫期第二天(L2),对寄主蛹注射9000ng/μl,7μl的dsRNA,48h后对其进行qPCR检测,PP16911的转录水平显著降低,表明该研究体系能用于干扰在蝶蛹金小蜂幼虫期高表达的基因,并可为该基因的后续功能研究奠定基础。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S476.3

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