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《浙江大学》 2001年
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白菜细胞核雄性不育相关基因mf-CYP450的分子鉴定、克隆和序列分析

叶纨芝  
【摘要】: 植物核雄性不育现象广泛存在于自然界中。由于用其育成的核不育两用系,既可 作为不育系又是保持系,因而具有重要的育种应用价值和理论研究价值。白菜 (Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino)起源于我国,是我国栽培面积最大、 产量最高的蔬菜之一,也是杂种优势利用最为普遍的一类作物,其雄性不育系的选育 及其应用基础研究深受人们的重视。白菜核雄性不育两用系自20世纪80年代育成以 来,已在一代杂种生产应用中发挥了重要作用。它的遗传背景比较简单,不育系中植 株的不育性状是由一对核隐性基因控制的,所以也是研究植物雄性不育分子机制很好 的材料。但是,目前对其的认识还停留在形态、细胞和生理水平,产生雄性不育的分 子机制还很不清楚,一定程度上限制了它在生产上的进一步利用。不断发展和完善的 分子生物学理论和技术为研究白菜核雄性不育分子机理提供了强有力的手段。 本研究以白菜核雄性不育两用系的测交后代群体为实验材料,一方面从DNA入手, 利用RAPD-PCR技术寻找与育性基因相连锁的分子标记;另一方面从mRNA入手, 利用DD-PCR技术,寻找和筛选与白菜核雄性不育相关的基因。研究中获得了一些初 步的结果,为探讨白菜核雄性不育发生的分子机理提供了一些信息。结果如下: (1)本实验证明,采用较高的复性温度,可以有效地防止非特异性带的产生, 优化了RAPD-PCR反应条件,提高了检测的准确性。对于白菜来说,42℃复性温度 更合适。通过对基因组DNA的提取方法加以改进,获得了高质量的白菜基因组DNA, 具有快速、简单、实用并且成本低的优点。 (2)系统比较分析了白菜核不育两用系不育株与可育株植株性状、育性、花器结构、 花粉扫描电镜形态和花蕾总蛋白的SDS-PAGE电泳,为从分子水平进一步研究核雄性不 育机理奠定基础。白菜核雄性不育两用系不育株群与可育株群花蕾总蛋白的 SDS-PAGE凝胶电泳结果表明:不育株和可育株各有一条特异带,分别简称为A-1、 B-1,A-1分子量大约为45kD,B-1分子量为50kD左右,而且两者的表达量都比较高; 而在茎、叶、子房中总蛋白电泳条带在可育株与不育株之间无差异;不育株与可育株 的总蛋白的种类差异不明显,SDS-PAGE电泳结果显示大约都有12条带。这一结果 与大白菜核雄性不育两用系花蕾总蛋白SDS-PAGE电泳结果不一致,大白菜核雄性不 育可育株中的总蛋白含量种类明显多于不育株,可育株中有20-22条区带,而不育株 仅有10条区带。这可能说明两种材料的核雄性不育产生原因不同,影响花粉败育的 方式也可能不一样。 (3)白菜核雄性不育两用系不育株与可育株花蕾的石蜡切片观察表明:不育株 小孢子败育发生在减数分裂时期。小孢子母细胞期小孢子母细胞排列松散而且细胞畸 形。减数分裂时期相对于可育株而言绒毡层细胞排列较为松散。不育株小抱子只进行 了一次减数分裂,不能进行第二次减数分裂形成四分体,没有四分小抱子的正常释放, 导致了花粉败育。随后处于第一次减数分裂的小抱子母细胞分散开,细胞畸形,伴随 着内溶物外溢的现象。内溶物外溢现象不断加剧,最后只剩下细胞空壳。这些异常现 象发生可能与许多基因的协同表达或不表达有关。 (4)分别以白菜不育株与可育株基因组 DNA混合池为模板,进行 RAPD-PCR 扩增,试验共筛选了412个随机引物,其中5107引物的MPD-PCR结果中可育株有 一特异条带,暂命名为S107E。为了获得该RAPD标记与育性基因的重组交换率, 以 1999年白菜核雄性不育材料进行 SI 07引物 99个单株的 RAPDICR验证。研究结 果表明,带 5107E RAPD标记的雄性可育株、不带 5107E MPD标记的雄性可育株。 带5107-B RAPD标记的雄性不育株、不带S107E RAPD标记的雄性不育株比例为 35:9:4:sl。5107-B RAPD分子标记与育性基因之间的重组交换率为 13.1%。 6)利用DDoCR技术对白菜核雄性不育两用系不育株群和可育株群花蕾做了 差异分析,对6种反转录模板和20种差异随机引物共120种组合中,获得了18条CDNA 差异带,这些差异带中大多数都是弱带,其中7条差异带为不育株所特有的,其余的11 条为可育株所特有,不育株与可育株都有自己特异的cDNA差异条带;这些cDNA差异 片段大多在 250hp叶 之间。对其中 6条差异显著的特异带 B03024、B03184《。 B0318-4、B0319-5、B0320-4和 B0320-4-a进行了 Northern分析,获得了一阳性 cDNA 片段B0302-4。经狈序表明,B0302-4共有463hp,GenBankBLAST查询表明B0302。4 与拟南芥第一条染色体上编码细胞色素P450蛋白的基因CyP86C4有84.3%的同源 性,而且CYP86C4基因组DNA序列中不存在内含子,这就为获得基因全长提供了 方便。 (6)根据B0302-4片段的已知序列,设计一特异引物,进行B0302-4片段3’端 序列的PCR扩增臼’RACEX 并且得到了B0302*片段带有完整的3’polyA尾的3’ 端序列。根据拟南芥中细胞色素P450基因5’端核昔酸序列的同源性,设计了两个简 并引物,与B0302-4片段的基因特异引物进行5’端序列的P
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S634.035.3

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【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
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【二级引证文献】
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6 刘德辉;赵慧渊;田蕾;高芝祥;邵建华;;盆栽白菜-水稻条件下氨基酸螯合微肥的肥效研究[A];全国第九届新型肥料开发与应用技术交流会论文资料集[C];2004年
7 曹家树;曹寿椿;;中国白菜及其相邻类群的分类[A];中国园艺学会成立70周年纪念优秀论文选编[C];1999年
8 张爱红;黄鹂;余小林;卢钢;向珣;曹家树;;白菜花粉发育相关多聚半乳糖醛酸酶基因比较[A];中国十字花科蔬菜研究进展 2009——中国园艺学会十字花科分会第七届学术研讨会论文集[C];2009年
9 阮玉蓉;胡帅;王芳展;刘振宁;刘亚培;余小林;;白菜BcRALF基因启动子的分离[A];中国园艺学会2011年学术年会论文摘要集[C];2011年
10 张波;侯喜林;;白菜晚抽薹基因的SSR标记[A];庆祝中国园艺学会创建80周年暨第11次全国会员代表大会论文摘要集[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 周莹;玉白菜将惊艳世博[N];扬州日报;2010年
2 本报记者 李银雁 龙军才;南宁白菜价格为何暴跌[N];中国经济时报;2010年
3 郭旭光;白菜入药治病多[N];中国中医药报;2010年
4 ;白菜分层吃法[N];保健时报;2005年
5 苗玲;韩国培植出抗癌白菜[N];农民日报;2005年
6 记者王城;中国白菜出口韩国救急[N];中国食品报;2010年
7 本报记者 刘述波 穆巍;秋菜窖储:“错时销售”供需双赢[N];哈尔滨日报;2010年
8 本报记者 吴丽华;悲惨的白菜[N];华夏时报;2011年
9 记者 许晓青 舒静;志愿者好心态:“做一棵靠谱的白菜”[N];新华每日电讯;2010年
10 徐宝康;从“白菜危机”看“身土不二”[N];人民日报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 叶纨芝;白菜细胞核雄性不育相关基因mf-CYP450的分子鉴定、克隆和序列分析[D];浙江大学;2001年
2 王永勤;白菜核不育两用系育性基因表达特征分析及其小孢子发育相关基因的分离[D];浙江大学;2003年
3 余小林;白菜雄性不育相关基因CYP86MF的功能验证及其人工不育系的创建[D];浙江大学;2002年
4 卢钢;白菜分子遗传图谱构建及其重要农艺性状的基因定位研究[D];浙江大学;2002年
5 张强;白菜花粉外壁蛋白基因BcMF5和多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF6的分离及其功能验证[D];浙江大学;2006年
6 田爱梅;白菜雄性不育相关基因BcMF15及其启动子的分离和功能验证[D];浙江大学;2008年
7 李梅兰;DNA甲基化与白菜的生长转变[D];浙江大学;2002年
8 崔辉梅;白菜与芜菁Ogura雄性不育系的获得及其创建过程中的遗传学研究[D];浙江大学;2004年
9 严继勇;BcpLH反义基因在大白菜中的转化及其功能的研究[D];浙江大学;2004年
10 徐恒戬;利用真空渗入法获得转基因抗虫白菜及其转化机理的研究[D];山东农业大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 帅琪峰;白菜核雄性不育两用系花蕾cDNA文库的构建及雄性不育相关基因的初步筛选[D];浙江大学;2004年
2 符庆功;白菜核不育两用系基因组AFLP差异片段筛选、克隆及序列分析[D];浙江大学;2003年
3 李春华;一个新型玉米光敏核雄性不育的发现、鉴定与遗传研究[D];河南农业大学;2010年
4 王丽;应用RAPD技术进行菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsenet Lee)种质遗传多样性的研究[D];西南大学;2006年
5 徐重益;白菜种质资源鉴定与更新方法研究[D];西北农林科技大学;2004年
6 贾可;磷肥在蔬菜上的产量效应及土壤中磷肥转化的研究[D];河北农业大学;2004年
7 陈鹏飞;大白菜类胡萝卜素分离鉴定和积累机理与调控研究[D];扬州大学;2008年
8 李勇;红菜苔春化作用相关基因及其天然早花突变的分子机理研究[D];重庆大学;2009年
9 黄细松;白菜开花时间相关基因的分子标记及春化相关基因的克隆和表达分析[D];浙江大学;2006年
10 张豫超;白菜雄性不育相关基因BcMF10的功能验证[D];浙江大学;2006年
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