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《浙江大学》 2001年
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果树提早开花的分子生物学基础研究

刘淑芳  
【摘要】: 目前果树品种改良主要依靠常规育种方法。长童期的存在严重制约了品种 改良进程,同时也直接影响它的经济效益。童期的一个最基本特征是实生苗不 具备开花能力,因此如何提早果树开花成为果树育种急需解决的关键问题之一。 关于果树开花的研究,目前主要集中于生理生化基础、环境因子和栽培技 术措施对实生苗开花的影响,但对果树开花的分子机制及其遗传控制的研究仍 处于“瓶颈”状态,迄今为止尚未见有相关报道。 花发育的研究在模式植物拟南芥菜上得到了空前的发展,利用拟南芥菜的 突变体已定位了影响开花时间的约80个位点,并克隆到了许多与开花诱导相关 的基因,并初步构建了花器官发育过程的遗传模型。其中一些基因促进开花, 另一些抑制开花;其中LEAFY基因是一个促进营养分生组织向花分生组织转变 的花分生组织特征基因,它已被证明是一个开花“开关”,是花形成最早的标记 基因,其过量表达能促进拟南芥、烟草和欧洲山杨等植物提早开花。LEAFY及 其同源基因在结构上高度保守、功能也比较相似。 本实验以柑桔和葡萄为材料,从基因克隆和基因转化两方面着手,研究提 早果树开花的分子生物学基础,寻找促进果树早开花的有效快捷途径。 基因克隆方面: 采用Uneven PCR技术获得LFY同源基因片段csLFY9903。采用根据已知的 不同种植物LEAFY同源基因3’序列的高度同源性,设计合成两个简并引物,与 12个十聚体随机引物分别作用,采用Uneven PCR技术从大三岛基因组DNA中 分离出一条长度约为1.3Kb的LFY同源基因片段(csLFY9903),序列测定表明, 简并引物一端568kb与本实验室先前得到的另一长883bp的片段部分重叠且互 相吻合,随机引物一端测得541bp,此区为高G+C含量。登陆基因库中检索结 果发现该片断与烟草中的LFY同源基因NFL的同源性高达90%; 利用改良法筛选文库得到了LFY同源基因片段csLFY9914。本实验用PCR 扩增结合铺噬菌体平板法筛选基因组DNA文库。按噬菌体浓度梯度铺噬菌体 平板,用一对特异性引物进行PCR扩增,保留标记了的阳性噬菌体菌液,进行 下一轮筛选,直至验证筛选得到单个阳性噬菌斑,扩大繁殖并保存。以特异片 段为探针进行原位杂交,筛选到含有目的基因的单个噬菌体。根据入噬菌体结 构特性,分别用 XhOI单酶切、Xh*和 Notl双酶切,结合图谱分析得到的是部 分插入的LFY基因片段。亚克隆后连接到pBS质粒中,得LFY同源基因片段 CSLFY99。序列测定结果反应仍然是终止在 342hp后的高 G+C区,且这段序 列与用 Uneven PCR得到的克隆片段序列互相重叠。在已知的 342hp序列中不 存在内含子,且根据外显子序列推导的氨基酸序列与已知的其它几种植物LEAF’Y 及其同源基因的同源性高达80-98%,核昔酸序列达88%左右。 基因转化方面: 建立了葡萄高效稳定的离体再生系统,为开展LFY基因对葡萄遗传转化研 究奠定基础。分别采用叶片和带芽茎段为外植体,接种于添加相同成分的培养 基 GS+ZT(2* mg/L)+IBA(.ling/L)OH6*)中,25 C,光照强度约 2000一 3000LX,光暗周期为16h/sh条件下培养二周后,发现叶片做外植体以生根为主, 且根系长势很好,而以带芽茎段为外植体则可诱导成完整植株,且根、茎生长 平衡且长势良好。实验使用了 ZT和 6—BA两种细胞分裂素,同时使用了*、 NAA和 IAA三种生长素,不同激素配比对茎段继代 10天后生长情况的影响表 明,培养基 GS+ZT(2* mg/L)+IBA(0二 mg/L)(pH6*-6.二冲激素比例既适合茎 段增殖,也利于根系生长,后续实验的基本转化培养基。此外,根据资料还建 立了高效稳定的柑桔再生体系。 利用己知全序列的拟南芥菜LEAFY基因序列,设计合成两个特异性引物。 利用冻融法,将携带有拟南芥的LEAFY全长CDNA基因的载体pDC202,转化 到土壤农杆菌 GV31 03中,用叶盘法转化葡萄和柑桔再生体系受体植株的带芽 茎段和子叶,通过初步抗性筛选、及包括PCR方法、Southern杂交等分子生物 学方法检测,成功地得到了转基因植株;葡萄和柑桔两种果树受体植物转化拟 南芥菜LEAFY基因后,都具有较高的转化频率,其转化芽再生频率分别为3.8% 和2.5%。 利用微体嫁接方式初步解决了柑桔转基因植株生根难的问题。整个实验过 程要求严格,为避免由于人为、自然因素而导致得来不易的转基因植株嫁接失 活,本实验在微体嫁接支持物的选用上做了适当改进,用与试管口等大的灭菌 海锦做支撑物,既可起稳定支架作用,又可保证植株吸收充分的液体营养物质 供其生长,同时极大地避免了操作过程中的污染。成功的得到了转基因植株的 微体嫁接苗。
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