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家蚕核型多角体病毒ptp基因分析与利用杆状病毒表达人白细胞介素-11的研究

郭锡杰  
【摘要】:(一) 酪氨酸蛋白磷酸酯酶(protein tyrosine phosphatase-PTPase)是生命细胞内 一类重要的酶,与细胞信号转导有关,对多种生理过程如生长、分化、代谢、 细胞周期调节和细胞骨架等有重要的调节功能,酪氨酸蛋白磷酸酯酶特异性地 催化蛋白质酪氨酸残基上脱磷酸反应,并与酪氨酸蛋白激酶共同作用,调控细 胞内蛋白质酪氨酸残基的磷酸化程度。某些细菌(如 Yersinia属的某些种)和 病毒(如痘病毒等)的基因组中具有一个开读框,编码酪氨酸蛋白磷酸酯酶, 与它们的感染性和致病性有关,其中痘病毒的酪氨酸蛋白磷酸酯酶具有双重底 物特异性,即可以同时催化蛋白质酪氨酸和丝/苏氨酸残基上的脱磷酸反应。 在杆状病毒科中,通过序列比较分析发现,某些核型多角体病毒的基因组 中具有编码酪氨酸蛋白磷酸酯酶的开读框。其中苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV)基因组中,该基因已被克隆和测序,其编码的蛋白质氨基酸序列 中具有PTPase催化活性区11核苷酸保守序列,(I/V)HCXAGXXR(S/T)G (HC基序),且具有酪氨酸蛋白磷酸酯酶和丝/苏氨酸蛋白磷酸酯酶双重活性。 本文根据己发表的AcMNPV和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)T3株(日本) 的基因组全序列设计引物,通过PCR方法,从家蚕核型多角体病毒中国镇江 株(BmNPV-ZJ)基因组DNA中克隆出酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因(ptp),测定了 该基因的核苷酸序列,比较了与相关病毒相应基因的同源性;并将该基因插 入到原核表达质粒在大肠杆菌中进行了表达。 BmNPV-ZJ酪氨酸蛋白磷酸酯酶(BmNPV-ZJ PTPase)基因的编码部分由 507个核苷酸组成,其中A为163、C为99、G为113、T为132,G+C含量 约为42%。根据其核苷酸序列推演的蛋白质由168个氨基酸残基组成,其中含 有酪氨酸蛋白磷酸酯酶催化活性区的11氨基酸“HC”基序,位于第117至127 位。该基因与苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)ptp和BmNPV-T3 株(日本)的ptp核苷酸序列的同源性分别为96.8%和98.2%。该序列己被美 国GenBank数据库收录,登录号为AF316871。 BmNPV上J PTPase的氨基酸全序列与 AcMNPV、BmNPV-T3、A聊V(芹 菜夜蛾核型多角体病毒)PTPase和OpMNPV(黄杉毒蛾核型多角体病毒) PTPase八 的氨基酸全序列的同源性分别为97O、97.60、960和600,而与 OpMNPV PTPase-2的同源性仅为 20%。 在 NCBI数据库中查找 BmNPVZJ PTPase的同源性序列,在所查找的 599381个序列中发现至少有14种mANA加帽酶其N端部分存在PTPase催化 活性区的“ HC”基序,如 HCAP(human mRNA capping enzymeL HCAP (Homo 枷lens mANA caPPing enzyme)、MCE(Mouse InRNA caPPing e卿me)、CeC”uenorhab公tls e…w InRNA caPPing emyme)等,但氨基酸 全序列的同源性只有31%-32O 将该基因插入到温度诱导型表达质粒 pBV22多克隆位点的 EcoR与 BamH I两切点之间,使其位于温控启动子PRPL之后,在大肠杆菌ll09中进行了 表达。表达产物在SDS-PAGE中呈现特异条带,大小约为19ku,与预计蛋白质 大小大致相同,薄层扫描定量分析的结果表明,PTPase的表达量占菌体蛋白总 量的2.2%。表达产物能催化对硝基酚磷酸钠(PNPP)的脱磷酸反应,并与反 应时间和反应体系中所含的酶量呈正相关,这种催化作用可被钒酸钠和ZnCI。 抑制,反应体系中 200 u mol/L钒酸钠或 lmmol/L ZnCI。几乎完全抑制表达产 物的催化活性。 (二) 白细胞介素 (I-11)是哺乳动物造血微环境中来源于骨髓纤维母细胞的一 种多功能细胞因子,具有重要的生物学功能。人白细胞介素 11(hIL。11)CDNA 核苦酸序列含有597个核昔酸,预期编码199个氨基酸的多肽,前ZI个氨基 酸为信号肽,成熟蛋白为 178个氨基酸残基的活性蛋白。自 1990年 IL 11分子 克隆成功以来,不仅几-门 的基因结构及其生物学功能相继得到阐明,并且先 后在哺乳动物细胞COS-l、小鼠成纤维细胞系NIH-3T3和大肠杆菌中进行表达, 获得了有活性的 IL-11。本研究选用缺少编码信号肽序列的 546核茸酸 hIL.11 -CDNA,构建了重组转移载体质粒,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒 (BmBacPAK)DNA共转染家蚕培养细胞株 BmN,获得了插入 l.门基因的 重组病毒,分别在培养细胞和蚕体内表达了具有活性的 hJL-11。 将携带有ML**A的质粒…**IL门,用限制性内切酶入hi酶切, 厂互 。Y 经 Klenow酶补平后,用 BamH酶切得到约 0.5 kb的 hIL-11 cDNA 片段,该 片段与经 Hue 11和 BamH双酶切的质粒 pBlu


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