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《浙江大学》 2001年
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原位杂交检测胃上皮细胞内幽门螺杆菌DNA

陆新良  
【摘要】: 前言 胃癌是全球第二位致死的恶性肿瘤,每年有超过750 000 人死于胃癌。胃癌的发生发展并不是由单一因素引起,而是多 种致癌因素多阶段相互作用的结果,在慢性浅表性胃炎→萎缩 性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌这一癌变模式中,幽门 螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)可能起着先导作用,是 胃癌发生的启动因子之一。Forman发现H.pylori感染人群发 生胃癌的危险性高出阴性组3倍,每年有300 000胃癌新病例 与H.pylori感染有关,这是已知胃癌病因中危险性最大的。 1998年来自日本的研究证实了长期H.pylori感染可以直接导 致蒙古沙土鼠发生胃腺癌。但H.pylori感染导致人类胃癌发生 的主要证据来自组织病理学和流行病学的研究,H.pylori感染 致癌机制尚未阐明。某些微生物,特别是乙肝病毒、EB病毒 等,作为生物性致癌因素已得到公认,整合是其重要的致癌机 制。Parsonnet推测H.pylori有类似病毒的致癌机制,即H.pylori DNA整合入宿主细胞基因组,引起细胞转化和癌变,但至今 尚无确切证据。H.pylori DNA要整合入胃上皮细胞基因组,必 须先进入胃上皮细胞内,并以某种形式长期存在,但对此研究 较少。本课题拟通过GenPoint原位杂交新型放大系统法研究 胃上皮细胞的H.pylori DNA,同时用免疫组织化学法检测胃上 皮细胞的H.pylori抗原,探讨H.pylori感染患者的胃上皮细胞 内是否存在H.pylori DNA及其可能的致癌机制。 材料和方法 l对象:收集经病理证实的慢性浅表性胃炎(CSG入慢性萎缩 性胃炎、肠上皮化生、异型增生和胃癌患者,行Hpylori IgG 抗体、快速尿素酶试验、胃翻膜MB染色和门 或卜-尿素呼 气试验等检查,按 Hpylori感染的科研诊断标准入选者共 112 例。Hpylori阳性组84例,其中慢性浅表性胃炎24例、癌前 变化(慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生和异型增生)25例、胃癌 35例;HpyIOri阴性组28例,其中慢性浅表性胃炎10例、癌 前变化厂慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生和异型增生)16例、胃 癌2例。 2 试剂:即用型免疫组织化学超敏SAP 染色试剂盒(Maxim BIOteCh,USAX 兔抗H.pylon抗体(DAKO公司\ 生物素标 记的 Hpylori特异性 I)NA探针(Maxim Biotech,USA人 GenPoint原位杂交新型放大系统试剂盒(DAKO公司),蛋白 酶 K(Meack公司,Germany),胃蛋白酶(Sigma公司,USA), RNA酶(上海生工生物工程技术公司)等。 3 方法: 3l 胃绷膜Hpylori抗原的检测 免疫组化SAP法:按即用型免疫组织化学超敏SAP染色试剂 盒操作,第一抗体为 1:40的兔抗 H.pylOOi抗体。阳性显色为黑 色。 3.2 胃缎膜 Hpylori DNA的检测 原位杂交:Hpylori DNA探针长度为 303hp、生物素标记、检 测 Hpylori M寸上6刀00蛋白基因。操作如下;烤片、脱蜡、水 化,0.2%Triton X刁 增加组织通透性 15分钟,pHZ的 HCI 变性碱性蛋白10分钟,豆%胃蛋白酶目标修复15分钟和20ug/ml 的蛋白酶K消化30分钟,0.2%甘氨酸的PBS洗涤终止消化, 10mg/ml的RNA酶破坏RNA30分钟,0.3%H*z甲醇原液灭活 内源性过氧化物活性30分钟,37oC预杂交60分钟,含lug/ml Hp DNA探针的杂交液 95C解链 15分钟,42oC杂交 60分钟后, 按DAKOGenPoint原位杂交新型放大系统试剂盒操作说明书 操作,阳性显棕黄色。 第2页 结果 1 原位杂交检测胃上皮细胞 Hpylori DNA 1* 胃上皮细胞核 HpylOI’i DNA阳性率: 随疾病发展的不同阶段,胃上皮细胞核 Hpylori DNA阳性率 依次升高。Hpylori阳性组的CSG、癌前变化和胃癌患者.胃 上皮细胞核 Hpylori DNA阳性率分别为 0.0%、16.0%和 3 7.1% (X’-12.56,P-O.002);而 H.pylon阴性组,可见 1例胃癌患 者的胃上皮细胞核 Hpylori DNA阳性。 1.2 胃上皮细胞胞浆 Hpylori DNA阳性率: HPyIOri阳性组的CSG、癌前变化和胃癌患者,胃上皮细胞胞 浆Hpylori DNA阳性率分别为 4.20、44.0O和 37二lO(X‘-10.86, P—0刀04\ 而HPylori阴性组,可见1例胃癌和1例癌前变化 患者的胃上皮细胞胞浆 HPylori DNA阳性(X‘-6.33,P-0.042人 2免疫组织化学检测胃瓢膜Hpylori抗原 Ll 胃新膜HPylori抗原的阳性率: HPylori阳性组的CSG、癌前变化和胃癌患者,抗原阳性率分 别为 50.0%、88*%和 37.l%(XZ=16.59,P-0*02);Hpylori 阴性组没有检测到Hpylori抗原。 2.2 胃绷膜Hpylori抗原的分布 在CSG、癌前变化和胃癌患者中,胃鄙膜Hpylori抗原阳性的 部位除了分布于剩液层、胃上皮表面和胃腺腔,还分布于上皮 细胞胞浆,其胞浆抗原阳性率依次升高,分别为0刀%、63石% 和 84.6%(X二一19.76,P二0.000)。 3 相关性分析 3* 胃上皮细胞核 Hpylori DNA与胞浆 Hpylori抗原的相关性 分析:胃上皮细胞核 Hpylori DNA与胞浆 Hpylori抗原两者均 一致共 gi例,其中均阴性 80例,均阳性 11例;胃上皮细胞 核有 H.pylon DNA而无胞浆 Hpylori
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R730.4

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