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《浙江大学》 2002年
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青菜离体再生和农杆菌介导遗传转化影响因子的研究

范正琪  
【摘要】: 本文研究了青菜的再生体系和农杆菌介导转化几种重要因子的影响,并首次探讨了辐射处理对青菜再生和遗传转化的影响。 为建立青菜的高频再生体系,对影响青菜再生的因素进行了分析。在青菜的离体培养过程中,外源激素对再生有着至关重要的作用。在所用的15种激素组合中,MS培养基中附加5mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA可以使再生频率达到最高。在培养基中添加AgNO_3对于叶离体再生具有明显的促进作用,5~7.5mg/L的AgNO3可以显著提高再生频率。不同苗龄的外植体其再生频率存在很大的差异,而且随基因型的不同而变化。最适苗龄一般在无菌苗培养3~6天,矮抗青为3天,上海青为4天,苏州青为6天。对子叶、子叶柄、带柄的子叶、下胚轴四种外植体的再生能力进行了比较,发现带柄的子叶再生频率最高,可作为建立青菜再生体系的适宜外植体。基因型对再生也有重要的影响,不同基因型的再生能力有很大差异。在所用的5个青菜品种中,以香港菜心的再生频率最高,为78%,其它依次为苏州青、矮抗青、上海青、高桦白菜。 为了能有效地杀除共培养后残余的农杆菌和筛选转化体,测定了青菜对5种抗生素的敏感性。经实验证明,离体培养的子叶对潮霉素的敏感性大于卡那霉素。因此,在青菜的遗传转化中应使用潮霉素作为筛选转化体,浓度以25mg/L为宜。在所用的羧苄青霉素、氨苄青霉素、头孢霉素三种抑菌抗生素中,根据它们对芽再生的影响,应首选羧苄青霉素。 为建立农杆菌介导青菜转化的稳定体系,以gus基因瞬时表达频率为指标,对影响转化频率的几个重要因子进行了优化。通过对菌液浓度、感染时间、共培养时间的梯度实验得出,菌液浓度为OD600=0.5、感染10~15分钟、共培养5天时,gus瞬时表达频率达到最高。不同的农杆菌其转化效果不同,在所用的2个农杆菌菌株中,用EHA105转化时,gus瞬时表达频率高于LBA4404。同一菌株与不同的质粒组合,其转化频率也有差异,在菌株EHA105与3种质粒pKUB、pKUC和pKSB的组合中,以EHA105(pKUC)的转化频率最高。基因型对转化频率也有重要的影响,在所用的5个青菜品种中,以高桦白菜的gus瞬时表达频率最高,为54%,其它依次为上海青、苏州青、矮抗青、香港菜心。 本文还研究了Y射线辐射处理对青菜离体再生和转化的影响。在再生试验时, 分别采用了Y射线处理外植体的供体一无菌苗和培养中的外植体。发现用l~SGy 的剂量处理外植体能明显促进不定芽的再生。在转化时,分别对在感染前和感染后 对外植体进行了辐射处理。结果表明在感染后用低剂量处理有助于圳瞬时表达的 提高。这一结果证明,在进行青菜的组织培养和转化时,辅以低剂量的Y射线处理, 可以提高再生和转化频率。
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