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甜蛋白基因Brazzein在大肠杆菌中的表达及对生菜和烟草的遗传转化

蒋迪  
【摘要】: 植物甜蛋白是从植物中发现的一类具有甜味的蛋白质。植物甜蛋白具有许多优点:甜度高,食用后代谢产生的热量少,不易被细菌所利用,糖尿病人可以食用等。目前已发现了七种甜蛋白,包括thaumatin, monellin, mabinlin, brazzein,pentadin, maraculin以及curculin。Brazzein是从产于西非的植物Pentadinplandra brazzein Baillon的果实中分离提纯出来的。在已发现的七种甜蛋白中,brazzein是分子量最小,分子结构简单,耐热性最好的甜味蛋白质。为了更好的利用甜蛋白,探讨Brazzein基因在原核生物和植物中的表达,本论文进行了一些研究,结果如下: 1 以合成的Brazzein基因为模板,通过引物设计引入突变位点,在基因5’末端引入Ala的密码子替代原有序列中编码pGlu的密码子。通过PCR扩增,获得突变的BRAZZEIN基因。将基因插入原核表达载体Pinpoint~(TM)Xa中,构建得到基因的原核表达载体PXaSB。表达质粒导入E. coil.菌株TG-1中,以IPTG作为诱导物进行诱导表达。设计了四种IPTG浓度以及五种诱导表达时间的对比,表达产物经SDS-PAGE检测表明,表达出了特异蛋白,并且以IPTG为100mM,诱导表达五小时,有最佳的表达量。经Western-blot分析表明,表达出的特异蛋白含有生物素纯化标签,证明融合蛋白中包含了mBRAZZEIN基因的表达产物。 2 以合成的Brazzein基因为模板,通过引物设计引入突变位点,在基因5’末端引入Ala的密码子替代原有序列中编码pGlu的密码子。通过PCR扩增,得到突变Brazzein基因。将获得的基因插入质粒pBI221 中,构建得到35S::mSB::Nos-ter重组DNA,再与35S::GUS::Nos-ter相连得到含有双基因的重组DNA。插入植物双元表达载体pBinplus中,构建得到Brazzein基因的表达载体pBGSB。 将突变的Brazzein基因和引导肽基因相连,再插入质粒pBI221中,构建得到35S::LPmSB::Nos-ter重组DNA,再与35S::GUS::Nos-ter相连得到含有双基因的重组DNA。双基因DNA插入植物双元表达载体pBinplus中,构建得到表达载体pBGLSB。 将构建好的两种植物表达载体,通过三亲融合法,分别导入根癌农杆菌菌株 浙江大学硕卜学位论义 门002) ***叩04禾 **3101:* *0中,得到表达的菌株。 3无菌萌发的4日龄生菜(品种“北山三号”)子叶切去尖端和基部,采用农 杆菌介导的叶盘转化法,用构建好的植物表达载体对生菜进行遗传转化。外植体 在无抗生素的诱芽培养基(MS+0.ling/16卫A+0.ling/INAA)中暗培养三天后, 移入加入抗生素 100mg/L Kan和 500 mg几 Cr的诱芽培养基,于组培室中进行诱 芽和抗性筛选。分化出的不定芽切下半张叶片进行GUS染色,呈阳性的植株从 外植体上切下,在生根培养基(MS+0刀sing/L NAA+50 mg几 Kan)中诱导根的 形成。植株形成根后,先后移入蛙石和营养土中培养。组培室中炼苗后,移入温 室白然光照条件下生长。取成年植株的叶片提取基因组DNA,进行PCR扩增鉴 定。 本论文中获得的再生生菜植株通过 GUS染色和 PCR扩增,证明导入了外源 mBrazzein基因。转基因植株在温室中开花,结子,己得到了转基因生菜植株的 种子。 4 以烟草(品种 SR)无菌苗叶片为外植体,采用农杆菌浸染的叶盘转化 法,用构建好的植物表达载体对烟草进行遗传转化。外植体置于无抗生素的诱芽 培养基(MS+0.sin旮16EA)上暗培养3天后,移入加有抗生素150mg/IKan和 500 mg几 Cr的诱芽培养基上诱导不定芽的分化。抗性芽经 GUS染色,呈阳性的 植株移入生根培养基门o 巧0mg/IKan)中诱导根的形成。植株形成根后,先 后移入蛙石和营养土中培养,组培室中炼茵后,移入温室自然光照条件下生长。 植株成年后,取叶片提取基因组DNA,进行PCR扩增。 本论文获得的再生烟草植株,经**S染色和**R扩增,证明导入了外源目 的基因。转基因烟草植株己在温室中厂花,结子。收获了转基因植株的种于。


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