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《浙江大学》 2002年
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棉花基因转化的研究及其在纤维品质改良中的应用

李晓  
【摘要】: 本研究以棕色棉细胞质雄性不育系的恢复系G-007为基因转化受体,以从木质醋杆菌中克隆的acsA、acsB、acsC和acsD4个纤维素合成酶基因(可能具有改良棉纤维品质的功能)为转化目的基因,以农杆菌介导法和花粉管通道法为主要转化手段,分别将含有单个、两个、多个目的基因的植物表达载体导入棉花中;经潮霉素筛选、GUS报告基因的活性检测、PCR检测、Southern杂交以及对转基因后代的遗传学分析,筛选出4个纤维品质有明显改良的转基因单株。通过比较不同的转化方法,初步建立了一套棉花基因转化的技术体系,归纳如下。 1 棉花基因转化受体的组织培养体系 对于棕色棉花愈伤组织再生系统,将5日龄无菌苗的外植体在含有0.1mg/L KT和0.2mg/L 2,4-D的LS基本培养基中进行愈伤组织的诱导,然后在含有0.5mg/L ZT的MS培养基上进行2-5次的继代培养后,转移至含有0.5mg/L ZT和0.2mg/L NAA的MSB培养基上进行分化培养;其中子叶的分化率为16.38%、胚根为10.2%、下胚轴仅为1.81%;同时,5μmol Ni~(++)和Zn~(++)的加入使下胚轴的绿苗分化率提高到16.5%。对于棕色棉花微茎尖再生系统,光下萌发的5日龄无菌苗的微茎尖在含有0.3mg/L的NAA和KT以及30g/L葡萄糖的MSB培养基中培养,其成活率可达85%;若将培养2-3周后的微茎尖转移至含有2g/L活性炭的培养基上培养,与对照相比其成活率提高到了92%,生根率也由原来的70%提高到87%。当由上述两种方法分化的绿苗长至2-3cm高时,将其移至含有0.5mg/L NAA的1/2MS培养基上进行生根培养,当试管苗长至约5cm高时进行移栽。 2 基于组织培养的纤维素合成酶基因的转化 农杆菌菌株GV3101经单菌落筛选、两次活化培养后用MS培养液稀释,并将萌发5日龄的棕色棉无菌苗子叶切片置于该稀释液中浸泡15min-20min,然后转移至铺有一层滤纸的共培养基上,于25℃共培养60h。经共培养的外植体在含有50mg/L潮霉素、500-750mg/L羧苄青霉素的培养基上进行抗性愈伤组织的诱导和继代培养,然后转移至含有30mg/L或不含潮霉素的分化培养基上分化绿苗;且在此其间进行GUS报告基因的跟踪检测。最后将所获得的抗性试管苗在含有20mg/L潮霉素的生根培养基上进行潮霉素的二次筛选并生根培养,共获得3棵转基因苗。用PCR检测和Southern杂交技术将所获得的抗性愈伤组织进行检测,结果表明单个目的基因(acsB)的转化频率为61.2%,两个连锁目的基因(acsA+acsB或acsC+acsD)的转化频率为50%左右,而两对连锁目的基因(acsA+acsB和acsC+acsD共4个基因)的共转化频率为21.3%。对于农杆菌介导的棉花茎尖分生组织基因转化,以光下萌发3-5天且生长健壮的无菌苗微茎尖为基因转化受体,与农杆菌共培养72h后,采用延迟选择法(延迟的时间为5-7d)以及潮霉素浓度梯度选择法,在经转化培养的1026个茎尖中最后仅获得1棵转基因植株。尽管该方法不受基因型限制且能快速成苗,但其转化频率却比较低。 3 纤维素合成酶基因的原位转化 3.1 花粉管通道法本研究采用整个花冠摘除以及分步注射法将供体质粒注入棉花中轴胎座,并施 用20ppm的GA。保铃剂;在被转化的942个子房中,共收获214个棉铃,经潮霉素抗性筛选和分 子检测最后获得了7棵转基因植株,其转化率达到了3.27%。而在花粉粒媒体介导法中,在被转 化的934个子房中,共收获了404个棉铃,最后获得了4棵转基因植株,其转化频率仅为0.99%。 因此,在这两种不同的花粉管通道技术中,于房注射法更适合棉花基因转化。 3.2农杆菌真空渗透转化棉花花粉授粉法农杆菌介导转化棉花花粉,首先要解决农杆菌凿液与花 粉粒共培养时花粉粒的破损以及花粉的生活力等问题,试验结果表明45%的蔗糖浓度的培养液(无 机盐含量为 0.l%HBO3、0.3%CaNO3、0二%MgSO4-7HZO以及 0.l%KNO3)为最佳的花粉转化 培养液;且棉花花粉在含有一定浓度农杆菌的该培养液中抽真空处理30min后:被转化的花粉经 联苯胺-甲茶酚反应法测定花粉的生活力;并将该花粉授粉于柱头后,取花柱和柱头采用棉蓝-乳 酸-酚染色法对花粉管进行染色:这些结果都表明转化处理对棉花花粉虽有一定的损害,但大部分 被转化的花粉都能够正常萌发并参与受精过程。在确证该方法可行性的基础上,本研究采用即节 省时间又节省花粉的集花授粉法收获棉花花粉,并对其进行农杆菌真空渗透转化,共授粉1038个 棉花柱头,收获312个棉铃,将收获的种于用潮霉素快速筛选并经进一步的分子检测得到5棵转 基因植株,其转化率为1.6%。 综合上述几种基因转化方法,农杆菌真空渗透花粉授粉法由于利用了自然繁殖过程,又利用 了TDNA的整合特性,它避兔了农杆菌介导的棉花组织培养受基因型限制的困难,同时也克服了 花粉管通道法采用裸露DNA整合机制不很明确的缺点,而且该方法还可以进行多个表达载体的多 基因共转化,
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