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《浙江大学》 2002年
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中华蜜蜂、意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2和透明质酸酶基因的克隆与表达

沈立荣  
【摘要】: 蜜蜂蜂毒(honeybee venom or Bv,下称蜂毒)是重要的蜂产品和古今中外应用广泛的天然药物,具有重要的开发利用价值。蜂毒磷酸脂酶A_2(BvPLA_2)和透明质酸酶(BvHya)是蜜蜂蜂毒的2个主要功能性蛋白,是医学、细胞分子生物学研究等方面具有重要价值的有效药用成分和工具酶,也是具有杀虫和抗菌作用的生物活性成分。本论文开展了中华蜜蜂(A.cerana cerana,中蜂)、意大利蜜蜂(Apismellifera,意蜂)蜂毒磷酸脂酶A_2和透明质酸酶基因的克隆与表达研究。 (一)中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2基因的克隆与表达 首先用RT-PCR方法克隆成功了中蜂蜂毒磷酸脂酶A_2(AcPLA_2)和意蜂蜂毒磷酸脂酶A_2(AmPLA_2)的成熟肽编码区基因,测序结果表明,二者的核苷酸序列全长均为405bp,所编码的多肽均为134氨基酸残基,推测二个多肽的分子量分别为14.7kD。对7种生物PLA_2氨基酸序列联配结果,AcPLA_2与AmPLA_2、大蜜蜂PLA_2、美国熊蜂PLA_2及黑腹果蝇PLA_2的同源性分别为95%、90%、54%、39%,AcPLA_2与家猪胰PLA_2和响尾蛇蛇毒PLA_2的同源性均只有13%,表明AcPLA_2与AmPLA_2的同源性最高。从7种生物的PLA_2分子系统树可见,AcPLA_2与AmPLA_2的进化距离最近。氨基酸序列分析结果表明,AcPLA_2与AmPLA_2具有相同的酶活位点、二硫键位点和Ca~(++)结合位点,在分子结构与功能上反映出很高的同源性和保守性。AcPLA_2属首次报道的基因序列,也是首个报道的中蜂基因序列,已作为新的基因序列在GenBank登录(登录号AF321087)。 将克隆到的AcPLA_2与AmPLA_2基因作EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后 浙江大学博士学位论文 中文摘要 pBacFastHTa 质粒的相应的多克隆位点中,获得重组杆状病毒供体质粒 pBacHT-AcPLAz和pBacHTAmPLA)然后分别转化大肠杆菌DH10Bac,经抗 生素和蓝白斑双重筛选,PCR 鉴定,获重组病毒B跳ffiid叭 和 Bacmid-AmPLAz。在无血清条件下,用 Lipofectin介导 Bacmid-AcPLAz禾 Bacmid Am P*AZ的基因组0*A转染生长状S《‘j态良好的粉纹夜蛾细胞TZ七B卜4后,分别 从被二者感染的Tn细胞抽提病毒DNA进行PCR检测,结果均得到与二者目的 基因大小一致的片段。SDS-PAGE 电泳结果表明,被 Bacmid-AcPLAz和 Bacmid-AmPLAZ感染的Tn细胞抽提物均有特异性蛋白条带。薄层扫描定量分析 结果表明,二者的特异性蛋白(表达量)分别占 Tn细胞总蛋白的 5.32%和 5.35 %。用来源于意蜂蜂毒的AffiPLAZ(天然纯AffiPLAZ)作抗原免疫家兔,获得了 效价很高的多克隆抗体,以此多克隆抗体作为一抗进行 Western blot检测, ACPLA。和 AInPLAZ的表达产物均具有很强的免疫活性,在约 18 kD处与天然纯 AJTIPLAZ同样有明显的阳性条带,与预期目的蛋白分子量大小一致。用蛋黄③ 磷脂)作底物作生物活性测定,二者的表达产物均显示类似于天然纯AmPLA。 及意蜂蜂毒的PLAZ酶活活性。这是ACPLAZ和AmPLAZ基因在杆状病毒-昆虫细 胞表达系统中的首次成功表达。 通过PCR分别从pGEM-ACPLAZ和pGEM-AInPLAZ获得目的基因,经低熔 点凝胶回收纯化后,分别用平末端克隆策略插入pETBlueq载体,构建成大肠杆 菌表达载体 pET-AcPLAz和 pET-AmPLA。,并在 Tuner(DE3)plac菌株中进 行了诱导表达。二者的表达产物在SDS-PAGE中均呈特异性条带,薄层扫描定 量分析结果,H者的特异性条带蛋白(表达量)分别占菌体总蛋白的4.61%和 4.320。ACPLA。和 AinPLAZ基因的表达产物经wCStCffi bio0均具有很强的免 疫活性,在约15kD处均与天然纯AmPLA。同样有明显的阳性条带,与预期目的 蛋白分子量大小一致。这是A。PLAZ基因在大肠杆菌中的首次成功表达,也是对 非人工合成的AZPLAZ基因在大肠杆菌中的首次成功表达。 (二)中华蜜蜂和意大利蜜蜂峰毒透明质酸酶基因的克隆与表达 首先用RT干CR方法克隆成功中蜂蜂毒透明质酸酶(AcHya)基因和意蜂蜂 区!互 ) 浙江大学博士学位论文 中文摘要 毒透明质酸酶(AmHya)基因,测序结果,二者的核苦酸序列全长分别为门 64 hp 和* 49 hp,可分别编码 387个氨基酸残基和 384氨基酸残基的多肽,推测二个多 肽的分子量分别为 42.5 kD和 42刀 kD。对 7种生物的 Hya氨基酸序列联配结果, AcHya与 AJTIHyffi gi
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q785

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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1 朱光辉;尸食性蝇类的生物化学特征用于死后间隔时间推断的基础研究[D];浙江大学;2003年
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【二级参考文献】
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