糖尿病大鼠心肌中PLB和SERCA的表达及其意义

【摘要】： 前言 糖尿病性心肌病是继发于糖尿病的重要并发症，患者发生充血性心力衰竭的危险性跟其他人群相比增加4-5倍，目前发现糖尿病性心肌病可出现在无大血管病变依据或心内膜活检证实无心肌毛细血管基底层异常的病人中，表明系一种非缺血性心肌病。心肌功能的障碍表现为心肌细胞收缩和舒张的异常，细胞内Ca~(2+)浓度的改变是心肌功能异常细胞病理生理机制的重要物质基础，细胞内钙池Ca~(2+)的释放主要由阿诺碱受体(ryanodine receptor，RyR)和三磷酸肌醇(inositol trisphosphate，IP_3)受体调控，游离Ca~(2+)则由肌浆网钙泵(sarcoplasmic reticulum Ca~(2+)-ATPase，SERCA)摄取进入肌浆网内，受磷蛋白(phospholamban，PLB)是控制SERCA活性的关键性调控蛋白，在去磷酸化情况下它是SERCA活性的抑制蛋白，磷酸化后对SERCA的抑制解除。有关PLB和SERCA在心功能不全中的作用已有较多研究表明它们参与了病理生理过程，对于它们在心肌中含量的变化尚存争议。在糖尿病性心肌病中PLB和SERCA表达量的改变研究甚少，对它们的研究有助于进一步揭示糖尿病性心肌病的发病机理，因此我们的实验观察糖尿病心肌病不同阶段心肌中PLB和SERCA表达量的变化，探讨PLB和SERCA含量的改变在糖尿病性心肌病心功能不全发病过程中的可能参与机制。 浙江大学硕士学位论文 材料和方法 l、研究对象： 正常对照组SD（Spr卿e－Dawley）雄性大鼠和SD雄性大鼠 采用四氧啼唆制备成的糖尿病模型。 2、主要仪器和试剂： 电泳转膜装置（Bio－Rad公司），抗PLB单抗。抗SERCA单 抗（ABR公司L羊抗鼠 IgG h抗一京中山生物技术公司人 ECL 试剂（浙江大学医学院分子实验中心人 四氧啼唆3igma公司人 3、实验方法 雄性sD大鼠，体重20口．280克左右，禁食12小时后，经尾 静脉注射四氧啼陡门 人对照组大鼠尾静脉注射同样容量 的蒸馏水，常规饲养，其间去除死亡大鼠，在2周、4周、6周分 别称重后处死，取心脏称全心重量然后去除心房在液氮中速冻后， 用不锈钢夹子击碎置干冻管于J0℃低温冰箱中保存。取约 100mg 左右的心肌组织称重以 100mg／ml的比例加细胞裂解液匀浆 10刁 分钟，4℃低温离心机中 14000rarn离心 15分钟，取上清液，以 Bradford 比色法测定蛋白浓度。再以Western印迹法测定，标本 加凝胶加样缓冲液后置沸水中变性，按每条泳道20Ug蛋白量加 样，用12％的分离胶及5％的积层胶经SDS聚丙稀酚胺凝胶电泳、 然后以200mA电流转膜90分钟，其后在TBST中摇晃1分钟放 入含5O脱脂奶粉的TB ST中封闭1小时，再在PLB或SERCA 单抗溶液中（l：1000浓度）温育过夜，将纤维滤膜在 TBST中洗 涤3A次，每次2030分钟后置辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG H抗溶液中（l：500浓度）在摇床上摇晃1小时，然后再用TBST 洗涤4次，每次30分钟，以ECL R显色，所得蛋白印迹用EPSON 2 浙江大学硕士学位论文 彩色图象扫描仪扫描后再用柯达影像分析系统分析定量。 4、统计学分析 所有数据以均数士标准差表示，组间比较采用矿检验，由＊PSS 10．0统计软件处理。 结果 1、2周、4周、6周糖尿病（diabetes mellitus，DM）大鼠体重和 心脏重量都低于对照组大鼠（P＜0刀1），但心脏／体重比在4周和6 周＊M组明显高于对照组o＜0刀1），2周时＊M组心脏／体重比较 对照组虽然增高但没有统计学上的意义（P＞0刀引。 2、Western印迹法显示2周、4周DM组大鼠PLB、SERCA的含 量及PLB／SERCA比跟对照组相比都没有明显的差异（P＞0．05）， 6周时DM大鼠心肌中PLB含量PLB／SERCA比值显著增 （P＜0刀1），而S＊＊＊A含量没有明显改变0＞0刀5）。 结论 l、DM大鼠心脏／体重比在4周和 6周时明显高于对照组，说明存 在着由于心功能的下降而导致的心脏的相对肥大。 2、DM大鼠在，L、肌中PLB含量及PLB／SERCA比值明显增高可 能参与了糖尿病性心肌病的病理生理过程，对心脏功能的改变起 着重要的作用c