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《浙江大学》 2002年
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抗淋球菌外膜蛋白PI的多克隆抗体的制备和临床应用初探

曾凤英  
【摘要】: 淋病是一种世界上广泛流行的性传播性疾病(STD)。我国近20年来淋病发病人数逐年上升,淋病的广泛传播已严重危害人类的身心健康和社会稳定。目前控制淋病传播尚缺乏有效措施,这主要与不能早期诊断有一定关系。因此,发展方便、快速、准确的实验室诊断方法,有利于尽早消灭传染源、切断传播途径、控制淋病蔓延。 目前淋病实验室检查方法包括涂片、培养、白细胞酯酶试验(LET)、抗原检测及基因诊断等,但主要依靠的还是涂片和培养。现有的各种淋病实验室检查方法仍存在一定的局限性,比如:涂片易发生误诊和漏诊,此类失误尤多见于女性;培养法虽然是诊断淋病的“金标准”,准确可靠,但是方法繁琐,因淋病奈瑟氏菌(NG)的营养要求高、理化因素抵抗力差、离体很快死亡并自溶而影响阳性率,不易作出早期诊断,且不适用于基层单位普查;LET缺乏特异性;抗原检测因淋球菌大部分表面抗原的抗原性不稳定而往往使检测失效,尚不推荐用于常规淋病实验室诊断;基因诊断法需要严格的实验条件,极易有假阳性。因此,在淋病实验室诊断中,传统培养法较为繁琐且当时不能出结果,其他非培养方法均不够理想,缺乏一种方便、快速、准确、廉价的检测手段,能在特别是患病率低的人群中推广应用。 理论上抗原检测能检查细菌性感染性疾病,如淋病、结核等。但是淋 20024E-江大学医学院硕土论文 球菌的许多表面抗原的抗原性不稳定,如菌毛、脂多糖及外膜蛋白11和 Ill在感染过程中易发生变异或丢失,以逃邂机体的免疫攻击,这样也使 得抗原检测往往失效,效果不甚理想。经实验证实只有表面抗原PI蛋白 的抗原牲是稳定的。蛋白 1叩I)为主要的淋球菌外膜蛋白,占外膜蛋白 的6be,有PIA和PIB两种结构形式,根据其特异的单克隆抗体进行分型, 可分为许多血清型。PI蛋白在淋球菌表面形成三维立体结构,构成跨膜 通道,与细菌的营养物质的运输、信息传导以及感染时致病有关。许多资 料表明蛋白PI在自然感染过程中抗原性质稳定,有较强的免疫性。但是 目前对自行克隆、GST系统表达并纯化而来的PI蛋白的研究只停留在体 外试验上,该蛋白在机体内免疫反应中的作用尚有持进一步研究. 本实验以由自行克隆、表达并纯化的PI蛋白为抗原进行研究,从而 了解该蛋白抗原在动物体内的免疫性的强弱情况,希望找到一种新的快速 实用的实验室诊断方法,并初步判断蛋白PI能否用来研制疫苗。 材料和方法 一 免疫对象 浙江家兔:家兔均雄性,体重约2.SKg,共3只。 二 临床资料 包括淋病患者和正常对照组。所有淋病患者标本均来自浙江大学医学 院附属邵逸医院及第二医院皮肤性病科门诊患者,共35例,其中成年男 性29例,年龄范围22-54岁;成年女性5例,年龄范围18-58岁;儿童 互例,5岁。正常对照组均来自邵逸夫皮肤性病科门诊的非淋病患者,共 30例,其中成年男性20例,年龄范围19-62岁;成年女性10例,年龄 范围17-55岁。每个病人取泌尿生殖道分泌物拭子两个,一个拭子分泌物 洗人NS 中用于与家兔血清多克隆抗体结合;另一个划线于 Thayer北rtin培养基进行培养。 4 2002年浙江大学医学院硕士论文 三方法 (抗体的制备 免疫接种前,每一家兔均耳缘静脉采血lml,并取 血清冻存备用。翅这公谚每只家兔用含PI 30()p抗原完全弗氏佐剂乳化 剂 Inil在背部多点皮内注射;30天后,用含PI 800屹抗原不完全弗氏佐 剂乳化剂采用同样方式进行釜二这助理忽篷;每隔15天,同样方式豆勿犟 全篷匝这;第七天耳缘静脉采血并测试血清抗体效价,双向兔疫扩散祛测 得 AbS效价 1:4以上,立即用含 PI 500屹的 PBS溶液 0.SSI耳静脉注射 进行量适二这地强逸塞,第五天心脏采血并分离出血清。 Q抗体的鉴定 采用巫包鱼塞艺散莲检测家兔免疫血清中多克隆抗 体的效价(l:吕以上符合要求)。 目免血清多克隆抗体对临床标本的检测 血清与临床标本的结合采 用还置遗集迭:将悬浮于生理盐水中的泌尿生殖道分泌物(抗原)测定 OD。co值,使其达1个OD。值,然后将抗原进行倍比释稀,得到不同OD。 值;同时将血清抗体释稀至抗体效价的2叶倍,即1:2或1:4释稀;将释 稀的血清抗体与分泌物抗原分别加入试管中混匀,于37℃水浴、过夜,
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R759.2

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