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《浙江大学》 2002年
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高三尖杉酯碱抑制K562细胞端粒酶活性及诱导细胞分化的研究

王蕾  
【摘要】: 高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)是从三尖杉属植物中提取的一种生物碱。我国在70年代将其用于急性非淋巴细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)的治疗取得良好疗效。早年认为HHT主要通过抑制蛋白质合成发挥抗肿瘤作用。近年的研究发现较高浓度的HHT主要诱导细胞凋亡,而低浓度HHT不引起细胞凋亡。临床采用小剂量长疗程HHT治疗AML取得一定疗效。本研究试图阐明小剂量HHT治疗的内在机理,为临床应用开阔思路并提供一定的理论依据。 我们以人急性红白血病细胞株K562细胞为对象,取5ng/ml,10ng/ml HHT作为实验浓度,采用MTT比色法观察小剂量HHT对K562细胞的生长抑制作用。结果发现,5ng/ml、10ng/ml HHT作用3天对K562细胞生长有一定抑制作用,抑制率分别为8.77±1.26%和20.28±1.55%。随作用时间延长,抑制作用增强。5ng/ml、10ng/ml HHT作用12天,对K562细胞的生长抑制率分别为33.33±3.02%和58.64±3.88%。提示5ng/ml、10ng/ml HHT对K562细胞的抑制作用在一定时间内具时效关系。小剂量HHT更好地发挥抗白血病作用可能需要延长治疗时间。 我们以Annexin V~(FITC)标记及碘化丙啶(PI)染色后用流式细胞仪检测该浓度HHT对K562细胞凋亡的影响。结果发现,5ng/ml HHT作用3~12天后K562细胞无凋亡。10ng/mlHHT作用3天和6天后亦不引起K562细胞凋亡,作用9天和12天时少量细胞出现凋亡, 浙江大学硕土学位论文 gi率均为 11.8%。提示sngiml HHT对K562细胞的生长抑制与N亡无关,10nghl HHT 作用6天内的细胞生长抑制也与凋亡无关,随作用时间的延长,该浓度HHT对细胞的生长 抑制可能与诱导凋亡有部分关系。 近年来抑制端粒酶活性成为抗肿瘤治疗的靶点之一。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是 端粒酶激活的决定性因素。以往研究己发现小剂量HHT可明显抑制白血病细胞的端粒酶活 性。为探讨小剂量HHT抑制端粒酶活性的机理,我们采用KruPP改良的荧光素标记端粒重 复扩增方法(TRAP)检测 K562细胞的端粒酶活性,同时用 RTPCR方法检测 K562细胞 hTERT 基因 mRNA表达的变化。结果发现,sngiml、10ng/ml HHT作用 3天和 6天后 K562细胞 的端粒酶活性及 hTERT mRNA的表达均显著下降,与细胞增殖能力下降一致。提示小剂量 HHT可能通过下调hTERT基因mRNA表达来抑制端粒酶活性,从而抑制K562细胞增殖。 导致端粒酶活性下阶的药物浓度在一定作用时间内并不引起凋亡,提示端粒酶活性和凋亡 的调节通路可能不同。有关端粒酶、端粒酶逆转录酶的调控机制尚不清楚,个别研究表明 c-myc基因可能参与hTERT基因表达的调控。因此我们也采用RTPCR方法检测了K562 细胞c-myc基因mRNA的表达,发现HHT作用后c-myc基因mRNA表达亦显著下降,与 hTERT mRNA表达和端粒酶活性的下调相一致。 为探讨小剂量HHT导致K562细胞端粒酶活性下降是否与细胞分化有关,本研究采用 紫外分光光度计比色法测定HHT作用后K562细胞内血红蛋白(Hb)含量变化。同时用流 式细胞仪检测成熟粒单细胞标记 CD!比及 HLA-DR的表达。结果显示:sng/ml HHT作用 3大利 6天后 K562细胞内 Hb含量有所增加,但与未处理组相比差异无统计学意义。而 10ng/,nl HHT作用 3天、6天后 K562细胞内 Hb含量与未处理组比分别增加了 l.96士0.23 o!1.86士0.22倍,差异有统计学意义。说明低浓度HHT作川一定时间后可能诱导K562细 胞向红系分化。同时发现sng/ml、10ng/ml HHT作用3大和6天后,K562细胞表面CDu 及HLA*R的表达均无明显变化,提示小剂量HHT在一定作用时间内可能无诱导K562 细胞向粒单系成熟分化的作用。 综上所述,我们认为:()小剂量 HHT(sng/ffil、10ng/ml)对 K562细胞生长有一定 2 一 抑制作用。随作用时间延长,抑制作用增强。(2)小剂量HHT显著抑制K562细胞的端粒 酶活性,同时在转录水平抑制K562细胞hTERT基因及c-myc基因的表达。说明小剂量HHT 可能通过下调hTERT基因表达来抑制端粒酶活性,c-myc基因可能参与这一过程的调控。 (3)小剂量 HHT在一定作用时间内抑制 K562细胞端粒酶活性与诱导细胞向红系分化有 关,而与细胞凋亡无关。(4)sngiml、10nghl HHT在一定作用时间内可能无诱导 K562细 胞向粒单系成熟分化的作用。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R733.71

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【参考文献】
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